在陆地气候下，筛选土耳其扁豆田是否存在镰刀菌枯萎病和根腐病

Yozgat 省的一项研究发现，枯萎病和根腐病等真菌病害等生物因素限制了扁豆的生产。在 95.4% 的样本中发现了 镰刀菌 分离株，这表明需要定期进行本地调查和定期监测，以实现可持续技术发展和有效的控制策略。

扁豆是一种重要的自花授粉豆科作物植物。它的生产受到各种生物因素的限制，尤其是导致枯萎病和根腐病复合物的真菌剂。该研究旨在了解植物病原真菌制剂的区域流行病学和病因学，以制定针对土壤传播 镰刀菌 属的控制策略。本研究调查了 2022 年至 2023 年尤孜加省 83 个扁豆播种地由常见 镰刀菌 物种引起的枯萎病、根腐病和冠腐病。收集有症状的扁豆植株用于真菌分离和鉴定。根据菌落形态对 镰刀菌 分离株进行分组，并在 PDA 培养基上培养。此外，使用 PCR 分析从 镰刀菌 分离株获得的基因组 DNA，并与 NCBI GenBank 中注册的其他 镰刀菌 分离株进行比较。使用 Mega 11 程序中的最大简约 （MP） 方法确定 镰刀菌 分离株之间的遗传关系。结果，Yozgat 省枯萎病和根腐病的平均发病率和病害严重程度分别为 16.9% 和 38.6%。在 95.4% 的样品中发现了 镰刀菌 分离株。 尖孢镰刀菌、 禾谷镰刀菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰 刀菌和 茄子镰 刀菌分离株的核苷酸序列同质性为 99.5%-100%，其中分离度最高的物种是 尖孢镰刀菌。 镰刀菌 分离株的 MP 树状图分为两个主要分支，第一个分支包括所有立 枯镰刀菌 分离株。第二个主要分支包括在本研究和 NCBI GenBank 中分离的其他 镰刀菌 物种。该研究建议定期进行当地调查，以确定 镰刀菌 枯萎病在扁豆中被抑制的频率。强烈建议及时抑制基于 镰刀菌的损害，以控制疾病并保护扁豆生产系统。

扁豆 （Lens culinaris Medik.） 是豆科的一种小型食用谷物豆科豆科植物，是一种自花授粉的凉爽季节作物，叶子呈针状，开出白色至淡紫色或深紫色^{的花朵 1}。它大约在 10,000 年前在新月沃土的美索不达米亚部分被人类驯化，并迅速传播到新大陆，包括地中海盆地和中亚，后来归化到美洲²。世界扁豆种植面积约为 550 万公顷，产量为 660 万吨³。土耳其在扁豆产量中排名^第 4，仅次于加拿大、印度和澳大利亚。土耳其的扁豆种植非常重要，占世界产量的 6.7%。土耳其的扁豆总产量为 474,000 吨，至少在 40 个省份生产⁴。土耳其约 89.5% 的扁豆产量由红扁豆和绿扁豆组成，占安纳托利亚东南部地区冬季作物的 10.5%。其余作物作为夏季作物种植。Yozgat （39.5%）、Konya （23.7%）、Kırşehir （16.3%）、Çorum （7.6%） 和安卡拉 （2.9%） 省份对绿扁豆生产做出了主要贡献⁴。扁豆的生产可能受到生物和非生物胁迫因素的限制。霜冻和干旱是夏季绿扁豆生产中最常见的非生物胁迫因素⁵。由 Ascochyta lentis、Rhizoctonia solani、R. bataticola、Aphanomyces euteiche、Pythium 和 Fusarium 物种引起的枯萎病、根腐病和冠腐病等真菌病害是最重要的真菌病害，它们会导致多种疾病，包括阻尼、幼苗枯萎病、枯萎病和根腐病，具体取决于感染的时间、宿主易感性和气象条件 ^6,7，8.

镰刀菌是一种在土壤、植物和有机基质中发现的丝状不完美真菌，是这些病原体中的一个世界性属⁹。它会导致各种疾病，如镰刀菌枯萎病、根腐病和根领腐烂，以及小麦中的镰刀菌枯萎病、葫芦中的镰刀菌枯萎病和大多数豆类的根腐病，包括扁豆 10,11,12。由镰刀菌属引起的维管束枯萎病、根腐病和根领腐烂病是全球许多扁豆种植区最重要的扁豆病害¹⁰。尖孢镰刀菌是与扁豆中的枯萎病、根腐病和根领腐烂相关的最常见的镰刀菌物种。在全球范围内，枯萎病、根腐病和冠腐病是由扁豆种植区的禾谷镰刀菌、孢子镰刀菌、公平镰刀菌、尖锐镰刀菌、镰刀菌、镰刀菌和轮枝镰刀菌引起的⁷。由镰刀菌属引起的枯萎病、根腐病和冠腐病发生在幼苗和成虫阶段，并导致叶子突然枯萎、干燥并最终死亡。该病的症状包括种子腐烂、根腐病、上部小叶枯萎、发育迟缓、收缩和叶子卷曲。在结荚的中后期，种子通常会萎缩，根的症状包括生长迟缓、褐色变色、主根尖端受损和次生根增殖。并非所有情况下都可以看到血管组织变色¹³。

在安纳托利亚中部地区，对扁豆中枯萎病和根腐病状况的研究数量有限。与夏季相比，尤孜加特气候温和适中，冬季降雨量充沛，被 Köppen 和 Geiger¹⁴ 归类为 Dsb（温暖潮湿的陆地气候）。平均气温为 9.6 °C，平均降水量为 512 毫米。Yozgat 位于北半球。夏季发生在 6 月、7 月、8 月和 9 月。了解导致疾病的植物病原真菌的区域流行病学和病因学信息对于针对土壤传播 镰刀菌 属制定不同的控制策略以控制疾病非常重要¹⁵.在此背景下，本研究的目的是通过在 Yozgat 省进行调查来确定和确定扁豆中枯萎病、根腐病和冠腐病的疾病参数（疾病患病率、发病率和严重程度），该省约占绿扁豆总产量的 40%，即致病性 镰刀菌 通过形态学和分子分析导致扁豆枯萎病和根腐病的物种，并通过进行致病性测试来确定 镰刀菌 物种的个体毒力水平。

注：材料表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 现场调查、采样和真菌分离

注意：根据 Endes 2022 的说法，调查工作于 2023 年和¹⁶ 年进行。在 Yozgat 省的 9 个地区共观察到 83 个扁豆种植区出现枯萎病、根腐病和根领腐病（图 1）。

1. 选择面积超过 1000 m² 的扁豆田作为采样区域。通过使用 1 m² 框架沿对角线之字形行走，从边界随机走到场地中心或中间来收集每个样本，将其随机放置在至少三个随机选择的不同点。从每个点收集出现疾病症状的扁豆植物，将它们放入纸袋中，然后转移到实验室用于真菌分离和鉴定研究。
   注意：转移到实验室的患病扁豆植物的根和根领首先用自来水清洗，以去除粗糙的残留物;后来，它们接受了表面消毒，以分离 Endes¹⁶ 描述的真菌病原体。
2. 将患病的植物组织浸泡在 70% 乙醇中 10-15 秒，然后用无菌水冲洗 3 次，每次 3 分钟。将它们全部在 1% 次氯酸钠 （NaOCl） 中保持 5 分钟，然后再次用无菌水冲洗 3 次，每次 5 分钟。
3. 在无菌柜中将湿植物组织放在滤纸上干燥，以完成表面消毒过程。之后，将消毒的植物组织切成 5-10 毫米长的块，并将 4-5 块放在培养皿（直径 90 毫米）中含有 0.01% 链霉素的 PDA 培养基上。将培养皿放入25±1°C的避光箱中4-7天，观察真菌生长。
   注：通过单孢子分离方法纯化发育中的真菌分离株。为此，Choi 等人¹⁷ 进行的关于获得属于子囊菌、担子菌、腔菌和丝菌的真菌的单孢子培养物的研究被修改和使用，如下所述。
4. 为了纯化真菌分离物，将在分离研究结束时获得的真菌分离物保存在25 ± 1°C的培养箱中12小时荧光光/ 12小时黑暗中15天，以促进在PDA上形成变形繁殖结构。
5. 用刮刀称取来自 15 天龄培养物的约 100 mg 真菌菌丝体，将其转移到 1.5 mL 无菌微量离心管中，然后用无菌塑料杵彻底研磨以进行均质化。
6. 加入 1 mL 无菌水并涡旋 1 分钟，以确保孢子转移到水中。要调整转移到水中的孢子数量，请用移液管吸取 20 μL 这种混合物，并在光学显微镜的 10 倍放大下检查孢子的数量。
7. 当孢子的量大于所需量时，以 1/10、1/100 和 1/1000 等比例稀释孢子-水混合物。在显微镜视野中提供含有 4-6 个孢子的混合物。
8. 取 100 μL 准备好的孢子悬浮液，将其转移到直径为 90 mm 的培养皿中，培养皿中含有补充有 0.1% 链霉素的 PDA 培养基。然后，用 Drigalski 刮刀将转移的悬浮液涂抹在 PDA 上。
9. 将准备好的培养皿在 25 ± 1 °C 的黑暗中孵育 12-24 小时。在此期间结束时，将从具有接种环的单个分生孢子发育的小块菌丝转移到含有 PDA 培养基的新培养皿中。从每个孢子获得的每种培养物都是单个孢子培养物。储存这些以用于致病性测试以及形态学和分子鉴定。
   注意：主要目的是使真菌分离株长时间存活而不改变其形态、遗传学和毒力。储存过程使用两种不同的方法进行^18,19。下面将详细解释本研究中使用的所有存储方法。
   1. 第一种存储样本的方法如下。在25±1°C下在PDA培养基上培养真菌分离物，12：12小时黑暗：光照15天，以获得直径为4mm的菌丝体盘，可以储存在无菌水中。
   2. 用软木蛀虫从上述条件下生长的真菌培养物中切割菌丝体盘（直径 4 毫米，10 个盘）。将菌丝体圆盘转移到含有 1 mL 无菌水的微量离心管中。将样品保存在 -20 °C 冰箱中的微量离心管中 6 个月。
   3. 第二种存储样本的方法如下。首先，从接种环获得的单个孢子培养物中取出一小撮纯真菌盘，并将其转移到含有补充有氯霉素、乳酸、氨苄青霉素、利福平、四环素、链霉素等的 PDA 的培养皿中。
   4. 在储存过程前，在 25 ± 1°C 下生长 5-10 天，12 小时：黑暗：光照条件。在 121 °C、15 psi 的高压灭菌器中切割并消毒 1 cm x 1 cm 通用滤纸 60 分钟。
   5. 将滤纸放入具有相同或选择性培养基的新培养皿中。从纯真菌培养物中切下菌落/孢子，并将它们放在每块的顶部。
   6. 密封培养皿并将它们置于适当生长条件下的培养箱中（如上所述）。真菌分离物在滤纸上缓慢生长。孵育约 15 天以确保完全定植。
   7. 在滤纸上形成孢子或完全形成菌落后，将单张纸转移到没有培养基的新培养皿中。然后将培养皿放入培养箱中，直到滤纸和真菌完全干燥（大约 20-30 天）。
   8. 干燥后，在每个无菌纸信封中放入 10 张滤纸，为每个信封贴上标签，将这些信封放入塑料袋中，并将装有信封的塑料袋存放在 -20 °C 的塑料透明容器中。
10. 根据下面给出的公式计算 Yozgat 扁豆枯萎病、根腐病和冠腐病的患病率，考虑每个扁豆田的病患病率，然后是省区名称。
    疾病患病率 （%） = （a / b） x 100
    其中 a 表示患病田的数量;b 表示一个选区中已调查字段的总数。
11. 根据 Bora 和 Karaca²⁰ 报告的加权平均法计算疾病的发病率。数田里每个方块的植物。在每个正方形中将它们分为患病植物和非患病植物，并根据下面给出的公式计算疾病患病率。
    疾病患病率 （%） = （x / y） x 100
    其中 x 表示患病植物的数量;y 表示调查的植物总数。
12. 根据 Öğüt²¹ 的等级 0-4 计算疾病严重程度，其中 0 = 没有症状，1 = 25% 的叶子出现轻度症状;2 = 26%-50% 的叶子出现中度症状;3= 51%-75% 的叶子严重萎黄和枯萎;4 = 非常严重的萎黄和枯萎症状，或相同顺序在超过 75% 的植物上出现干燥、脱落、生长迟缓或枯叶（图 2）。
13. 使用以下公式和获得的量表值¹⁶ 计算疾病严重程度。
    疾病严重程度 （%） = [ ∑ [ i （ni x vi） / （V） x N）] x 100
    其中 ni 比例值中的植物数量;vi 标度值;V 最高刻度值;N 观察到的植物总数;i 表示类的数量。

2. 气象数据

1. 进行调查研究。对于该协议，在 2022 年 5 月和 2022 年 6 月以及 2023 年期间进行了调查。从 Yozgat 省气象局获取 2022 年、2023 年和漫长年份 3 月至 7 月期间的温度、相对湿度和总降雨量值（表 1）。

3. 形态学鉴定

1. 将 镰刀菌 分离株的文化（菌落颜色、气生菌丝体、菌丝体生长速率）和分生孢子（分生孢子尺寸、形状、颜色和隔膜数量）特征与早期研究的特征进行比较，并初步鉴定真菌物种。
2. 从组中选择代表性样品用于形态学鉴定。根据上述单孢子分离方法纯化这些样品。在此期间，观察 镰刀菌 分离株的菌落色素沉着特征以及微/大分生孢子和厚垣孢子结构。
3. 为了促进获得的纯真菌培养物中微形态结构的形成，如微/大分生孢子和衣原体孢子，在PDA上于25±1°C和12小时孵育：12小时黑暗：在培养箱中光照25-30天。通过光学显微镜测量每个 镰刀菌 分离株的分生孢子的长度和宽度。此外，使用数码相机随附的光学显微镜记录分生孢子的结构、形状、颜色和隔膜或不带隔膜。
4. 根据上述观察结果，根据物种水平对 镰刀菌 分离株进行分组，如 Leslie 和 Suerell²² 中所述。

4. 分子鉴定

注：使用以下方法提取 镰刀菌 分离株的总基因组 DNA，该方法对 Cenis²³ 的方案略有修改。使用 Aras 和 Endes²⁴ 描述的方案对镰刀菌分离株进行 PCR 分析和电泳。

1. 真菌基因组 DNA 提取
   1. 从在 PDA 上生长的 镰刀菌 分离物的新鲜培养物（10 天龄）中，用无菌手术刀刮取 100 mg 菌丝体，然后将其转移到 2 mL 微量离心管中。将试管在 -20 °C 下孵育过夜。
   2. 孵育过夜后，向试管中加入 500 μL DNA 提取缓冲液（200 mM Tris-HCl pH：8.5、250 mM NaCl、25 mM EDTA、0.5% 十二烷基硫酸钠），并用无菌塑料杵压碎。
   3. 随后，向试管中加入 150 μL pH 5.2 的 3M 乙酸钠 （NaOAc），并在 -20 °C 下孵育 30 分钟。在此阶段之后，将试管以 4,000 x g 离心 10 分钟。
   4. 离心后，将试管顶部的 400 μL 上清液转移到新试管 （1.5 mL） 中，并加入等体积的异丙醇 （2-丙醇）。将新管在 -20 °C 下孵育 30 分钟。在此期间，轻轻混合试管 5 次或 6 次。
   5. 以 4,000 x g 离心 10 分钟以沉淀基因组 DNA 并丢弃管中剩余的所有液体。
   6. 将 1 mL 70% 乙醇作为白色或奶油色沉淀物添加到基因组 DNA 沉淀中，在试管底部形成。轻轻地上下混合试管 4x-5 次约 1 分钟，丢弃试管中的所有乙醇。然后，在层流中打开试管 30 分钟，以完全蒸发 DNA 沉淀上的乙醇。
   7. 为了溶解基因组 DNA 并长期储存，向试管中加入 50 μL TE（1M Tris-HCl pH：8.0;0.5M EDTA pH 8.0）缓冲溶液，并将试管在 65 °C 的水浴中孵育 1 小时。在此期间，轻轻地上下混合试管 8x-10x。将溶解在 TE 缓冲溶液中的基因组 DNA 储存在 -20 °C 的深冰箱中，以用于分子研究。
2. 对于 PCR 研究，使用寡核苷酸引物 ITS5 F （5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3'） / ITS4 R （5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3′） 扩增 rDNA²⁵ 的 ITS 区域。使用 2.5 μL 10x PCR 缓冲液、2.5 μL MgCl₂ （25 mM）、2.5 μL dNTP （2 mM）、0.5 μL 每种引物 （10 μM）、2 μL 模板 DNA、0.5 μL Taq DNA 聚合酶（1 U/μL，Fermantas）和 14 μL sQH 2 O 进行每个 PCR 反应，总体积为 25 μL。
3. 对于 25 μL PCR 反应，在 95 °C 下运行以下 PCR 程序 2 分钟（初始变性），然后运行 40 个循环;95 °C 持续 30 秒（变性），55 °C 持续 45 秒（退火），72 °C 持续 90 秒（延伸）和 72 °C 持续 5 分钟（最终延伸）。在 90 V 下在 1.5% 琼脂糖凝胶中电泳 PCR 产物 1.5 小时，在 1x TAE（Tris 碱 - 冰醋酸 - EDTA）缓冲溶液中制备。
   1. 要制备用于凝胶电泳的 TAE 缓冲液，请将 242 g Tris 碱溶解在 700 mL 无菌水中;加入 57.1 mL 冰醋酸;加入 100 mL 的 0.5 M EDTA 溶液，并加入无菌水将体积调节至 1 L。将 1 L 50x TAE 缓冲液的最终 pH 值调节至 8.5。要制备 1x TAE 工作缓冲液，请将 49 份无菌水添加到 1 份 50x TAE 缓冲液中。
4. 用 0.5 μg/mL 溴化乙锭对凝胶进行染色，并通过使其在 UV 透射仪上可见来目视检查它们。
5. 为了检查根腐病菌和冠腐病菌分离株之间的系统发育关系，通过 PCR 获得 ITS 基因碱基序列，这些序列是通过供应商双向合成的 （5'-3' 和 3'-5'）。使用 Blast 程序将碱基序列与 NCBI（国家生物技术信息中心）网站上的基因数据以及世界上其他 镰刀菌 分离株的 ITS 基因的碱基序列进行比较。使用它来识别物种水平的分离株，如下所述。
   1. 转到 https://www.ncbi.nlm.nih.gov 网站。单击 Popular Resources 部分中的 BLAST 选项卡。
   2. 单击新窗口中的 Nucleotide BLAST 选项卡。在新窗口的 Enter Query Sequence 部分中，以 Fasta 格式输入基本序列，并在 Job Title 部分中写下研究的名称。
   3. 随后，检查 标准数据库（nr 等） 在 Database 选项卡的 Choose Search Set 部分。
   4. 选中 Highly similar sequence （megablast） 在 Optimize for 选项卡的 Program Selection 部分，然后单击页面底部的 BLAST 选项卡。
6. 使用 MEGA 11 系统发育分析程序确定 镰刀菌 分离株之间的系统发育关系。使用 ClustalW 程序对齐碱基序列，并根据 ITS 基因²⁶ 的最大简约性创建分离株的遗传家谱。
   1. 要下载 Mega 软件，请访问网站 https://www.megasoftware.net，然后安装 Mega 软件。MEGA 软件免费提供，用于研究和教育。
   2. 首先，将序列保存为桌面上的 FASTA 格式的记事本文件 （.txt）。运行 Mega 软件程序，然后单击 ALIGN 选项卡。单击窗口中的 Edit/Build Alignment 。随后，检查 创建新路线 在新窗口中，然后单击 OK 确认。
   3. 点击 DNA 选项卡。删除 1.序列，然后转到 Edit file，然后单击 Insert Sequence from File 选项卡。打开包含序列且位于桌面上的记事本 （.txt） 文件。
   4. 在此阶段，所有序列都显示在屏幕上。首先，单击屏幕上出现 的 Any Sequence ，然后使用 CTRL + A 标记所有序列。打开 对齐 文件并单击 对齐 由 Clustal W 从那里，然后单击 OK 以默认设置运行程序。
   5. 检查序列比对的差异后，转到数据文件，单击 系统发育分析 ，然后单击窗口中复选框中的 否 ，了解序列是否合成蛋白质。我们的序列不合成蛋白质，因为它们属于 ITS 区域。
   6. 返回 Mega 软件的主窗口。单击 Phylogeny（系统发育） 并选择 Construct/Test Maximum Parsimony Tree（s）（构建/测试最大精简树）。在新窗口中，选择 Bootstrap Method 进行系统发育测试，然后输入 bootstrap 值 1,000 以测试分支强度。在 Gaps/missing Data Treatment 选项卡中，选择 Partial Deletion，选择 Subtree-pruning-Regrafting （SPR） 作为 MP 检索方法，然后单击 OK 确认作。
   7. 等待分析结果显示系统发育树。

5. 致病性试验

1. 对于通过分子方法鉴定的 镰刀菌 属物种的每个代表性物种，使用四种分离株进行致病性研究。在 24 °C、16 小时荧光灯/8 小时黑暗光周期、湿度为 65% 的空调房中进行致病性研究。
2. 将扁豆种子播种在黑色塑料瓶中，这些小瓶有 45 个直径为 5 厘米的孔。将每个小瓶置于 1% 次氯酸钠中 3 分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗 3 次。将种子在无菌柜中干燥 24 小时，然后每个孔中播种一粒种子。
   注意：对疾病敏感的 Kayı 91 品种的扁豆种子用于所有致病性测试⁶。采用幼苗浸泡技术作为接种方法²⁷。
3. 将每种分离株的纯培养物在 PDA 中于 24 °C 孵育 7-10 天。用刮刀从培养基表面刮下从原种培养物中培养的菌落，并使用无菌蒸馏水制备孢子/菌丝体悬浮液。
4. 通过 4 层粗棉布过滤去除悬浮液中的大残留物，并在血细胞计数器的帮助下将孢子/菌丝体浓度调节至 1 x 10⁶ 个孢子/mL。
5. 在此阶段之后，当它们有 2-3 片真叶时，将先前在小瓶中生长的幼苗的根连根拔起。用自来水清洗，用无菌针头轻微伤害根部。将这些幼苗浸入准备好的孢子/菌丝体悬浮液中 3 分钟，然后将它们移植到含有无菌土壤/泥炭 （2：1; v/v） 混合物的塑料瓶中。
6. 对于用作对照的幼苗，将其根连根拔起，伤害它们，然后仅将它们浸入无菌水中种植它们。接种过程后 3 周根据 0-4 等级进行致病性试验评价。
7. 在对计算出的疾病严重程度值进行角度变换后，将获得的值进行方差分析，并根据 Tukey 的 HSD （p = 0.05） 检验评估平均值之间的差异。疾病严重程度： 0%-15% 的分离株评价为极低毒力 （LV），16%-35% 的分离株评价为低毒力 （LV），36%-50% 的分离株评价为中等毒力 （O），51%-70% 的分离株评价为高毒力 （VV），71%-100% 的分离株评价为极高毒力 （VV），无疾病症状的分离株评价为腐生或附生分离株。

疾病参数的测定
根据枯萎病、根腐病和冠腐病症状，调查了覆盖 Yozgat 九个不同地区的 83 个扁豆播种区，面积为 1.1984 x 10⁶ m² （表 2）。枯萎病或根腐病症状在所有田地中都出现。然而，Yozgat 的枯萎病和根腐病的发病率被确定为 16.9%，Sorgun 和 Sarıkaya 地区的疾病严重程度为 38.6%。在 Şefaatli （26.4%）、Bo?...

众所周知，镰刀菌枯萎病会在世界某些地区造成严重的经济产量损失³¹.该疾病首先在匈牙利报道³²，后来在埃及、印度、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、土耳其、叙利亚和美国等许多国家报道³³。Kumar 等人³⁴ 报道了扁豆枯萎病、根腐病和根领腐病的广泛分布，据报道，全球至少有 26 个国家/地区发生...

作者声明没有利益冲突。

这项研究得到了博佐克大学项目协调应用和研究中心 BAP 部门的支持，项目编号为 FÇD-2022-1096。这项研究是 Sevim Atmaca 博士研究的一部分。