优化小鼠肾小球系膜细胞的分离和纯化

本研究开发了一种用于分离小鼠系膜细胞 （MCs） 及其 离体 细胞培养物的优化方案。这些细胞可以多次传代、冷冻、恢复和培养，而不会影响细胞生长或蛋白质表达。

系膜细胞 （MCs） 是位于肾小球中间间隙的基质细胞，在肾小球稳态中起关键作用。自 1980 年代以来，已经开发和优化了分离、纯化和培养肾小球 MC 的方法，用于生物医学研究，特别是在肾脏病学领域。小鼠是肾脏疾病研究中最常用的实验动物模型。在这项研究中，我们开发了一种用于小鼠 MCs 分离和 离体 细胞培养的优化方案。这些细胞可以多次传代、冷冻、恢复和培养，而不会影响细胞生长或蛋白质表达。这种优化的方法显著缩短了研究人员的研究时间，并实现了长期细胞保存。在基本的生物医学实验室中，可以轻松获得这些程序所需的设备，并且程序步骤很简单。获取靶细胞只需要 2-3 周，与现有方法相比至少缩短了 1 周。

肾小球是一个毛细血管网络，执行过滤血液以形成尿液¹ 的基本任务。系膜细胞 （MCs） 嵌入系膜基质中，位于肾小球毛细血管之间，具有独特的位置，可通过其不同的功能影响肾小球动力学²。MC 在肾小球中起着至关重要的作用，包括肾小球发育、肾小球毛细血管的结构支持、吞噬作用和肾小球基底膜基质的产生³。系膜细胞的研究对于促进我们对肾脏生理学和病理学的理解至关重要。

系膜细胞参与病理状况也值得注意。为了应对肾小球损伤或疾病，如糖尿病肾病或肾小球肾炎，系膜细胞可以增殖并分泌过多的细胞外基质成分，导致肾小球硬化和肾功能受损 ^4,5。因此，了解系膜细胞的功能和调节机制对于开发肾脏疾病的治疗策略至关重要。

小鼠系膜细胞使研究人员能够模拟和探索 IgA 肾病⁶、糖尿病肾病⁷ 和局灶节段性肾小球硬化 （FSGS） 等疾病所涉及的分子和细胞过程^8,9。鉴于它们在肾纤维化和炎症中的作用，小鼠肾小球 MC 经常用于临床研究以评估治疗化合物的疗效 ^9,10。此外，小鼠系膜细胞是研究各种信号通路对肾功能影响的重要工具，包括 RhoA/ROCK 通路¹¹ 和转化生长因子-β （TGF-β） 通路¹²。这些研究有助于阐明这些信号分子如何促进肾脏疾病的进展。无论是用于疾病建模、治疗开发还是信号转导研究，小鼠 MC 仍然是促进我们对肾脏健康和疾病的理解的重要资源。

Mackay 等人于 1988 年建立了一种从转基因小鼠中获取肾小球上皮细胞、系膜细胞和内皮细胞离 体 细胞系的方法¹³。Wilson 和 Stewart 开发了一种从患者肾组织中分离和纯化原代 MC 的方法，该方法涉及三轮筛分和用培养基¹⁴ 进行大量洗涤。Menè 和 Stoppacciaro 还提出了一种从患者或大鼠肾组织中分离原代 MC 的方法。该技术包括两轮筛分、两次针推和胶原酶消化。将从 4-8 只大鼠肾脏获得的细胞接种在六孔板上，尽管产量相对较低¹⁵。这些方法需要在加工前将肾脏解剖成小块。此外，这些方法大约需要 3-4 周才能产生纯化的 MC。

小鼠是肾脏疾病研究中最常用的实验动物模型。然而，仍然缺乏分离小鼠 MC 的系统方法。在这项研究中，我们开发了一种用于小鼠 MCs 分离和 离体 细胞培养的优化方案。当使用原代小鼠肾 MC 进行实验研究时，可以采用这种方法。与以前的方法相比，这种方法无需在消化前进行组织切割和筛分。相反，使用细胞研磨机研磨整个小鼠肾脏，并直接用胶原酶消化。然后将消化液筛分两次，将所有细胞收集在第二个筛子上并重新悬浮。该方法允许两个小鼠肾脏产生足够的细胞，以便在 10 天内接种 2 至 3 个 100 mm 培养皿。随后使用含有 D-缬氨酸的专用培养基通过培养和纯化获得纯化的 MC。这些细胞可以多次传代、冷冻、恢复和培养，而不会影响细胞生长或蛋白质表达。这些程序所需的设备对于基本的生物医学实验室来说很容易获得，整个过程只需 2-3 周即可获得目标细胞。该方法适用于涉及小鼠 MC 的研究，以研究肾脏相关疾病或机制，因为它高效且节省时间。

动物实验符合 ARRIVE 指南，所有动物程序均按照国家立法和欧盟委员会指令 （2010/63/EU） 进行。小鼠被饲养和维持在无病原体的条件下，符合四川大学华西医院动物护理和使用委员会的要求。所有实验动物研究均经四川大学华西医院动物护理与使用委员会批准。在该测定中，使用 8 周龄 C57BL/6JGpt 雄性小鼠进行系膜细胞分离。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 图 1 说明了分离和纯化小鼠肾小球系膜细胞的程序。

1. 小鼠 MCs 分离试剂的制备

注：确保所有试剂和设备都是无菌的。

1. I 型胶原酶 （750 U/mL）：称取粉末并在使用 RPMI 1640 前不久溶解。
2. 系膜细胞培养基 1：将 RPMI 1640 与 2 mM 谷氨酰胺、17% FBS、抗生素（100 单位/mL 青霉素加 10,000 μg/mL 链霉素）和 0.1 U/mL 胰岛素混合。
3. 系膜细胞培养基 2：将 RPMI 1640（D-缬氨酸）与 2 mM 谷氨酰胺、10% FBS、抗生素（100 单位/mL 青霉素加 10,000 μg/mL 链霉素）、ITS-G（胰岛素、转铁蛋白、硒溶液 100x）和 0.1 U/mL 胰岛素混合。将系膜细胞培养基储存在 4 °C 并在制备后 1 个月内使用。
4. 细胞冻存培养基：以 7：2：1 的比例制备 RPMI 1640 培养基、血清和 DMSO 的混合物。

2. 小鼠 MC 的分离

1. 通过 CO₂ 窒息然后颈椎脱位（遵循机构批准的方案）人道地处死小鼠。将胴体浸入含有 75% 酒精的烧杯中进行消毒，然后将动物转移到无菌工作台面上。
2. 用剪刀和镊子在无菌条件下去除小鼠的肾脏，将它们放入培养皿中，用 EBSS（厄尔平衡盐溶液）冲洗，然后用镊子小心地去除结缔组织和肾胶囊。
3. 将肾脏垂直切成两半，加入 3-4 mL 胶原酶 I 溶液，然后用塑料细胞杵研磨。
4. 将培养皿中的所有组织和溶液移液到 15 mL 离心管中。用 1-2 mL 胶原酶 I 溶液冲洗培养皿，以确保转移所有组织。将溶液置于 37 °C 的摇床中，以 120 rpm 振荡 30 分钟。然后，加入等体积的终止液（培养基 1）。
5. 从 15 mL 离心管中吸取溶液，将其通过 100 μm 细胞过滤器，然后将滤液收集在 50 mL 离心管中。
6. 将步骤 2.5 中的液体通过 40 μm 细胞过滤器，仅保留 40 μm 细胞过滤器上的细胞。用培养基 1 反复冲洗过滤器，以确保在过滤器上收集尽可能多的细胞。将收集的细胞从过滤器转移到新的 50 mL 离心管中。
7. 将悬浮液以 600 x g 离心 5 分钟（在室温下），然后根据细胞密度将细胞重悬于细胞培养皿中。通常，将两个肾脏的细胞重悬于两个或三个 100 mm 培养皿（10 mL 培养基 1/100 mm 培养皿）中。将培养皿置于 37 °C 细胞培养箱中，含 95% 空气/5% CO₂。
8. 第二天在显微镜 （40×） 下检查细胞形态和粘附。如果培养基中存在漂浮的死细胞，请使用移液器从培养皿底部去除培养基，注意不要干扰附着的细胞。
9. 沿培养皿的内边缘加入 1-2 mL PBS 以冲洗细胞。使用移液管去除培养皿底部的所有 PBS，最后沿培养皿的内边缘添加 10 mL 培养基 1。

3. 小鼠 MC 的纯化

1. 分离后 1 天，按照步骤 2.8 中的说明，轻轻洗涤培养基并用新鲜培养基 1 替换培养基，以去除非贴壁细胞。在相差显微镜 （40×） 下观察肾小球细胞。
   注意：明亮的球形代表肾小球，而周围的细胞表现出鹅卵石状特征，这是上皮细胞的特征（图 2A）。
2. 观察 1-3 天后的细胞形态（图 2B-C）。星状和纺锤形细胞将出现在鹅卵石细胞周围，如图 2D 所示。
3. 当细胞达到 80% 汇合时（通常在 7-10 天内），用无菌 PBS 洗涤细胞两次，然后用 0.25% 胰蛋白酶溶液（每 100 mm 培养皿 2 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液）对细胞进行胰蛋白酶消化。
4. 初始细胞胰蛋白酶消化过程可能需要大约 20 分钟。加入胰蛋白酶后，将培养皿置于 37 °C 培养箱中。在相差显微镜 （40×） 下实时观察该过程，以评估细胞的胰蛋白酶消化。
5. 当大多数细胞表现出圆形形态并从培养皿表面分离时，通过添加等体积的培养基 2 来终止胰蛋白酶消化过程。
6. 将细胞以 600 × g 离心 5 分钟（在室温下），然后将其重悬于培养基 2 中。通常，将一个 100 mm 培养皿中的细胞重悬于两个 100 mm 培养皿（10 mL 培养基 2/100 mm 培养皿）中。
7. 第二天更换培养基 2。在显微镜下观察大量悬浮细胞和细胞碎片 （40×），因为只有 MC 可以在 D-缬氨酸培养基中存活和增殖¹⁶。每 1-2 天更换一次培养基以去除死细胞。培养物中的贴壁细胞是 MC（图 3A-D）。确定分离的 MC 的生长速率（图 3E）。
8. 一旦细胞达到 80% 汇合，用胰蛋白酶消化并传代它们。MC 通常需要大约 5-10 分钟才能进行胰蛋白酶消化。

4. 小鼠 MC 的长期保存

注：由于原代细胞可能会随着时间的推移和多次传代而分化和突变，因此在细胞纯化后冷冻并储存 MC 以进行长期保存。

1. 使用移液管沿培养皿底部边缘小心去除上清液，用无菌 PBS 洗涤细胞两次，然后用 0.25% 胰蛋白酶溶液（每 100 mm 培养皿 2 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液）胰蛋白酶消化。按照步骤 3.3-3.8 中所述的胰蛋白酶消化步骤进行作。
2. 胰蛋白酶消化后，加入等体积的培养基 2 以终止该过程，并将整个液体转移到 15 mL 离心管中。将细胞以 600 × g 离心 5 分钟（在室温下），弃去上清液，并将细胞重悬于 1 mL PBS 中以计数细胞。
3. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。从 1 mL 重悬细胞溶液中取出 20 μL，并将其添加到专用细胞计数板中，以确定细胞总数。根据细胞计数，将它们重悬于细胞冷冻保存培养基中（每 10⁶ 个细胞 1 mL 细胞冷冻保存培养基）。
4. 将细胞溶液转移到冻存管中（每 2 mL 冻存管 1 mL 细胞冻存培养基）中，缓慢冷冻至 -80 °C，然后转移到液氮进行保存。
   注：将细胞重悬并接种在细胞培养皿中，以便根据需要进行扩增。细胞应在完全表征后在第 3 代和第 8 代之间使用¹⁷。

5. 小鼠 MC 的鉴定

注：细胞传代两次后，使用以下技术鉴定小鼠 MC。

1. 小鼠 MC 的 Western 印迹
   注：该程序所需的试剂在 补充表 1 中提供。
   1. 按照与 3.3-3.8 和步骤 4.1 相同的步骤对细胞进行胰蛋白酶消化。
   2. 收集细胞后，裂解细胞以提取蛋白质并测量蛋白质浓度。
   3. 取适量样品（通常为 20 ng），加入上样缓冲液，在 100 °C 下变性 5 分钟。
   4. 用 10% SDS-PAGE 凝胶或 7.5% SDS-PAGE 凝胶分离蛋白质 （20 ng），然后以恒定电压将其转移到纤维素膜上。
   5. 用 5% 无脂牛奶封闭膜，然后在 4 °C 下与一抗在摇床上孵育过夜。
   6. 用 TBST（含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水）洗涤 3 次后，在室温下与二抗孵育 1 小时。
   7. 使用成像系统检测信号。
      注：本研究中使用的一抗包括小鼠抗 αSMA （1：500）、兔抗波形蛋白 （1：2000）、兔抗纤连蛋白 （1：2000） 和小鼠抗 GAPDH （1：50000）。本研究中使用的二抗包括过氧化物酶偶联的山羊抗兔 IgG （H + L） （1：5000） 和过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG （H + L） （1：5000）。
2. 小鼠 MCs 的免疫荧光染色
   注：该程序所需的试剂在 补充表 2 中提供。
   1. 按照与步骤 3.3-3.8 和步骤 4.1 相同的步骤对细胞进行胰蛋白酶消化。
   2. 重悬细胞并计数。取 1 x 10⁵ 个细胞，将它们添加到 15 mm 玻璃底细胞培养皿中（每 15 mm 玻璃底 1 mL 培养基 2 个）。
   3. 用 4% 多聚甲醛固定 MC 15 分钟（每 15 mm 玻璃底部 1 mL 4% 多聚甲醛），然后用 PBS 洗涤 3 次。
   4. 用 0.1% Triton X-100 处理 MC 10 分钟以透化细胞膜。
   5. 用 PBS 再洗涤 3 次后，在室温下用 3% BSA PBS 溶液封闭细胞 30 分钟。
   6. 洗涤细胞，并与原代抗小鼠αSMA和抗兔波形蛋白抗体在4°C下孵育过夜。
   7. 在室温下，与与红色 Alexa 594 偶联的二级驴抗小鼠 IgG 和与绿色 FITC 偶联的驴抗兔 IgG 孵育 1 小时。
   8. 在室温下使用 DAPI 进行核复染 1 分钟。
   9. 添加荧光安装介质并用载玻片盖上。使用共聚焦显微镜分析细胞。
      注：本研究中使用的一抗包括小鼠抗 αSMA （1：200） 和兔抗波形蛋白 （1：200）。本研究中使用的二抗包括与红色 Alexa 594 偶联的驴抗小鼠 IgG （1：400）、与绿色 FITC 偶联的驴抗兔 IgG （1：400） 和 DAPI （1：1000）。
3. 小鼠 MC 的流式细胞术
   1. 按照与步骤 3.3-3.8 和步骤 4.1 相同的步骤对细胞进行胰蛋白酶消化。
   2. 重悬细胞并计数。取 5 x 10⁵ 个细胞，用 3 mL PBS 洗涤一次。
   3. 在流管中用 100 μL PBS 重悬细胞，然后加入 1-2 μL 抗小鼠 PDGFRB （CD140b） 抗体。
   4. 将细胞在冰上避光孵育 30 分钟，然后通过流式细胞术分析。

本研究开发了一种用于小鼠 MCs 分离和离体细胞培养的优化方案。据我们所知，目前尚无用于体外验证原代 MC 的标准方法。根据以前的出版物，MC 的特征是 αSMA、波形蛋白和纤连蛋白的表达 ^3,14,15。Western blot 分析检测 MCs 的表达水平。本研究中分离的 MC 表现出 αSMA 、 纤连蛋白 和 波形蛋?...

肾脏相关疾病非常普遍，由于小鼠与人类的遗传相似性和成熟的疾病模型的可用性，因此被广泛用作研究这些疾病的主要动物模型。系膜细胞通过提供结构支持、调节肾小球滤过和参与免疫反应，在维持肾小球的正常结构和功能方面起着至关重要的作用。虽然存在各种从人、大鼠和鸡中分离系膜细胞的实验技术 14,15,19，

作者声明不存在利益冲突，无论是财务还是其他方面。

这项工作得到了中国国家自然科学基金（第 82470196 号、第 82070219 号和第 81870157 号）和四川大学教职工启动基金对 Y.Z. 的资助。