人 BAMBI^高MFGE8^高 脐带来源的间充质基质细胞的分离

BAMBI^高MFGE8^高 MSC 是构成异质性人 UC-MSC 的三个主要亚组之一，其分离有助于充分了解该亚型的特性和功能，以便其未来应用以提高特定疾病的临床疗效。在这里，我们提出了一种分选 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSC 的方法。

脐带来源的间充质基质/干细胞 （UC-MSCs） 具有低免疫原性和强大的免疫调节作用，可用于治疗各种疾病。人 UC-MSC 是一个异质性群体，由三个主要亚群组成，具有不同的细胞形状、增殖速率、分化能力和免疫调节功能。以前，发现 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCs（从 UC-MSCs 中成功分离的第一个亚组）未能缓解狼疮性肾炎。因此，该亚组在 MSC 疾病治疗中的功能和潜在机制仍然未知。有必要分离并进一步研究 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCs 的表型、代谢和功能，以完全了解该 MSC 亚组的性质。在该协议中，我们描述了一种从人 UC-MSC 中分离 BAMBI^高MFGE8^高 亚群的详细方法。通过流式细胞术分选，用两个表面标志物 BAMBI 和 MFGE8 标记 UC-MSCs 的亚群。分离的细胞进行培养并通过流式细胞术分析进行验证。通过 RT-qPCR 鉴定在 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCs 中表达的特异性基因。该方案导致高效和纯净的细胞分选，并描述了 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSC 的标记物谱。

人间充质基质/干细胞 （MSC） 是能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和其他细胞类型的体细胞祖细胞¹。MSC 最初从骨髓中分离出来，广泛来源于脐带、脂肪组织和其他组织²。由于 UC-MSC 易于获得且表现出低免疫原性和免疫抑制作用，因此它们被广泛用于治疗各种疾病的临床试验 ^3,4,5。尽管 MSC 疗法在治疗疾病方面显示出有前途的潜力，但治疗效果在个体之间并不一致⁶。然而，MSC 治疗不稳定的原因仍不清楚。

分子波动、形态学、分化能力和治疗功能构成了 MSC 的异质性。一些研究还假设 MSC 构成具有不同功能的亚群 ^7,8，^并通过单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 探索 MSC 异质性 ^9,10。结果显示，人类 UC-MSC 具有具有特定转录组学特征的不同亚群，而很少有研究成功分离出所谓的 MSC 亚群。我们之前通过 scRNA-seq 和生物信息学分析根据它们的特征将人类 UC-MSC 分为三个亚组，其中 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSC 亚群被进一步纯化和功能测试¹¹。然而，该亚组未能缓解狼疮性肾炎。因此，有必要测试 BAMBI^高MFGE8^高 MSCs 在其他疾病中的治疗效果，以了解它们的真实功能。

该方案描述了通过流式细胞术荧光激活细胞分选 （FACS） 从人 UC-MSC 中分离 BAMBI^高MFGE8^高 亚组的方法以及 BAMBI^高MFGE8^高 亚组的特征。

本研究是根据 1989 年赫尔辛基宣言中规定的原则进行的，并经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（批准号：202019701）。人类脐带是从南京大学医学院附属鼓楼医院的健康母亲自然分娩后获得的，她们对在本工作中的使用给予了知情同意。原代 UC-MSC 是从人脐带中分离出来的，如前所述¹¹。

1. 分离前的 UC-MSC 培养和鉴定

1. 一旦 MSC 达到 70-80% 汇合度 （P0），用 PBS 洗涤细胞一次，并在 37 °C 下加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 2 分钟。 然后，加入 9 mL 完全培养基以中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，并以 300 × g 离心 5 分钟以收集细胞。弃去上清液并加入适当的完全培养基以重悬细胞。将每个培养皿中的细胞转移到三个 T75 培养瓶 （P1） 中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中培养。
2. 通过胰蛋白酶消化将 UC-MSCs 传代 2x 后，在 P3 处，通过步骤 1.1 中描述的相同步骤收获细胞。离心后，弃去上清液。将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液（含有 2% FBS 的 1x PBS）中并计数。加入 FACS 染色缓冲液至终浓度为 5-10 ×^{10 6} 个细胞/mL，并将细胞悬液保持在冰上。
3. 将每管 100 μL 的该细胞悬液分配到不同的 1.5 mL 试管中。在 4 °C 下向细胞中添加针对 CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD79 和 HLA-DR（均为 1：200）的同种型对照和 FACS 抗体 30 分钟。
4. 用 FACS 染色缓冲液洗涤细胞 2 次，并以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 200 μL FACS 染色缓冲液中，用于流式细胞术分析以鉴定 MSC 标志物。

2. 通过流式细胞术分离 BAMBI^高 MFGE8^高 UC-MSC

1. 分离 BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSC 时，将 UC-MSC 培养至密度约为 5-10 × 10⁶ 个细胞。用 0.5 mM EDTA 解离细胞 5 分钟，直到它们开始形成圆形形态，加入完全培养基以将细胞转移到 15 mL 锥形管中，并上下吹打细胞悬液数次以制备单细胞悬液。使用 10 μL 细胞悬液对细胞进行计数并计算收获的细胞总数。将装有细胞悬液的锥形管以 300 × g 离心 5 分钟以收集细胞。
2. 将细胞重悬于 1 mL 完全培养基中，至终浓度为 5-10 × 10⁶ 个细胞/mL，并将细胞悬液保持在冰上。
3. 将细胞分成四个 1.5 mL 微量离心管（仅限空白细胞;BAMBI 标记的细胞;MFGE8 标记的细胞;以及 BAMBI 和 MFGE8 标记的细胞）。
4. 将适当浓度的一抗（MFGE8 和 BAMBI，均为 1：100）添加到试管中，混合，并在室温下孵育细胞 15 分钟。
5. 用 1x PBS 洗涤标记的细胞一次，并以 300×g 离心 5 分钟。丢弃上清液。将细胞重悬于 1 mL 完全培养基中，向细胞中加入偶联的荧光二抗（山羊抗兔 IgG H&L Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647，均以 1：1,000 的比例），混合，并在室温下在黑暗中孵育细胞 15 分钟。
6. 如步骤 2.5 所述，用 1x PBS 洗涤标记的细胞一次。将细胞重悬于 500 μL 完全培养基中，通过 70 μm 细胞过滤器过滤以去除团块和碎片，然后将滤液转移到 15 mL 试管中进行流式细胞术分选。
7. 在不添加抗体（阴性对照）的情况下运行空白细胞管，并调整前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC），以用抗体染色对阴性群体的规模进行门控。
8. 运行单个抗体标记的细胞管（即，MFGE8 + 山羊抗兔 IgG H&L Alexa Fluor 488，或 BAMBI + 山羊抗兔 IgG H&L Alexa Fluor 647）作为门控对照，以确定阳性在图中开始的位置。
9. 运行实验样品管以分类和收集 BAMBI^高MFGE8^高 细胞群。
10. 将分选的 BAMBI^高MFGE8^高 MSC 接种在 24 孔板中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中培养细胞。
11. 当分选的 BAMBI^高MFGE8^高 MSC 生长两次传代以获得足够的细胞时，解离细胞并进行分选后分析，以通过流式细胞术确保分选细胞群的纯度，如步骤 2.1-2.9 所述。或者，如果收集的细胞数量太少，则用常规免疫荧光检查针对人 BAMBI 和 MFGE8 表达的分选细胞的纯度。

3. BAMBI^高 MFGE8^高 MSC 的表征

1. 在 12 孔板中培养分选的 BAMBI^高MFGE8^高 MSC，在显微镜下检查它们的细胞形态，并将它们与未分选的 MSC 进行比较。
   注意：通常，BAMBI^高MFGE8^高 细胞比未分选的 UC-MSC 生长得更快。
2. 当细胞在 12 孔板中大约 90% 汇合时，吸出细胞培养基，用 1x PBS 洗涤细胞一次，并向细胞中加入 500 μL RNA 提取试剂。在室温 （RT） 下缓慢摇动板 5 分钟。
3. 移液混合物并将其转移到不含 RNase 和 DNase 的试管中。加入 100 μL 氯仿，盖上试管，涡旋 15 秒，剧烈摇动混合物。然后，让试管在 RT 下静置 3 分钟。
4. 将试管在 11,000 × g 和 4 °C 下离心 15 分钟。
5. 将大约 200 μL 的上层水层转移到新试管中。加入相同体积的异丙醇，并彻底上下移液数次。然后，让混合物在 RT 下静置 10 分钟。
6. 在 11,000 × g 和 4 °C 下离心 15 分钟。 丢弃上清液。
7. 向试管中的沉淀中加入 500 μL 75% 乙醇，然后轻轻倒置试管数次。
8. 将试管在 6,000 × g 和 4 °C 下离心 5 分钟。 丢弃上清液。以 6,000 × g 重复离心一次 10 秒，通过移液管小心吸出剩余液体，并在室温下干燥试管。
9. 加入 10 μL 不含 RNase 的水以溶解 RNA 沉淀，并使用分光光度计测量 RNA 浓度。
10. 按照制造商的说明从多达 1 μg 的总 RNA 中合成第一链 cDNA。
11. 根据制造商的说明，使用 qPCR 试剂盒检测和定量基因表达。
    注：所用 DNA 引物的序列列于 表 1 中。

图 1 显示了人 UC-MSC 的细胞表面标志物表达谱。培养的 MSCs 的 CD44 、 CD73 、 CD90 和 CD105 表达呈强阳性，CD14 、 CD34 、 CD45 、 CD79 和 HLA-DR 表达呈阴性。从培养的人 UC-MSC 中分选 BAMBI^高MFGE8^高 MSCs，扩增 3-4 代后通过流式细胞术重新分析其 BAMBI 和 MFGE8 表达（图 2）。在这个过程中，BAMBI^高MFGE8^高 MSC 的...

该方案描述了如何从人 UC-MSC 中分离和富集 BAMBI^高MFGE8^高 亚群。该方法对于进一步研究该 MSC 亚组的形态、生长和功能非常重要。一些步骤对于成功分离 BAMBI^高MFGE8^高 细胞和高产量至关重要。

首先，要考虑的最关键的技术方面是在本方案中使用适当的细胞解离溶液。虽然使用常规的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 解离 MSC 进行传代?...

作者声明他们没有利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金（第 82271843 号）的支持。