BALB/c-nu 小鼠肝癌的建立及三棱家参方治疗效果的探讨

在这里，我们提出了研究三棱佳神方对原位肝细胞癌 BALB/c-nu 小鼠的治疗和血管抑制作用的分步方案。

肝癌的致死性和对化学药物的耐药性迫使人们寻找治疗肝癌的传统草药的有效处方。可重复、易于作且高度模拟肝癌病理生理过程的动物模型是成功筛选有效候选药物的先决条件。同时，可靠的药物疗效评价指标和手段也是抗肝癌药物研发的保障。

三棱家神方剂，中药代表方剂，含 Sparganium stoloni erum， Buch.-火腿。（三棱）， 人参 CA Mey。（人参）， Rheum officinale Baill。（rhubarb） 和 Ligusticum chuanxiong Hort. （Chuanxiong） 用于治疗肝癌。本实验方案描述了冻干三棱甲神方的制备和 BALB/c-nu 小鼠原位肝癌的建立过程。采用组织病理学染色、癌症标志物免疫组化检测、小鼠 体内 成像、鸡胚绒毛膜尿囊膜试验探讨三冷家神方对肝癌组织恶性增殖的抑制和抗血管生成作用。数据显示，三棱甲参方能有效抵抗肝癌组织的恶性增殖，表现为肿瘤质量体积减少、病理损伤改善、癌症标志物ki67水平降低。

对血管生成的优越抑制也表明，三棱家参方可能具有治疗和预防肝癌进展和恶化的潜力。整个实验方案展示了中药成分治疗小鼠肝癌的综合过程，为肝癌模型的建立和优化，以及防治肝癌的药物研发提供了参考。

肝癌是一种起源于肝脏的致命癌症，是全球癌症相关死亡的第二大常见原因¹。美国和一些发展中国家的肝病发病率很高，到 2030 年，全球肝癌病例可能超过 100 万例²。由于吸烟、肥胖、饮酒等不健康的生活习惯，以及乙型肝炎、丙型肝炎等病毒的肆虐，肝癌的发病率和死亡率逐年显著增加³ 年。肝癌作为一种组织学特征不同、预后较差的异质性恶性肿瘤，发病率范围非常广泛，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和纤维板层肝癌⁴。肝癌通常在晚期被诊断出来，许多晚期患者不适合放射治疗⁵。多激酶抑制剂索拉非尼是一种高度接受的晚期肝癌患者药物，但患者通常会在短时间内产生显着的耐药^{性 6}。目前，免疫检查点抑制剂 PD-1 和 PD-L1 联合索拉非尼在控制肝癌发展方面取得了一些进展，但治疗效果仍存在争议⁷。

原位肝癌是肝癌的一种早期类型：癌细胞没有扩散到肝组织周围或发生器官间转移，肝脏的功能没有受到很大影响⁸。由于原位肝癌一般不会出现明显的不适症状，部分患者可能会出现轻度肝痛、疲劳等症状⁹。在临床实践中，肝脏彩色多普勒超声检查和增强的计算机断层扫描检查可以诊断肝脏中大量的占位性病变¹⁰。虽然可以通过手术切除未扩散和转移的局部肝癌，但存在一定的手术风险和患者不可避免的心理负担¹¹。放化疗可以杀死全部或部分肝癌细胞，药物治疗患者的长期免疫抑制可能会影响治疗效果并增加其他疾病的风险¹²。因此，寻求安全有效的药物治疗肝癌早期预防和治疗是遏制肝癌进展和恶化的关键。

中医治疗肝癌的原理是基于体内平衡与和谐的概念。中医认为肝癌是身体能量的不平衡或不和谐，称为气，会影响肝脏¹³。肝癌的中医治疗涉及多种方法，包括草药、针灸、饮食疗法和生活方式建议。其原理是恢复气的平衡，加强身体的防御机制，促进身体的自愈能力^14,15。中医中的肝癌属于“鼓室”和“肝蓄积”类别。早在《黄帝内经》就对其症状有详细记载，肝癌是由血瘀、正气虚引起的，以祛瘀、消除鼓室、增强机体抵抗力巩固体质来治疗¹³.三棱丸起源于元代名医罗天一所著的《魏生宝剑》一书。它由三种药物组成：Sparganium stoloni erum、Buch。-火腿。（Sanleng）、川芎园艺 （Chuanxiong） 和 Rheum officinale Baill。（大黄）。这三种药物均可进入肝经，对治疗肝癌有治疗价值¹⁴。三棱佳参配方由 16 克三棱、16 克人参 C.A.Mey 组成。（人参）、8 克大黄和 2 克川雄（图 1），用于补肝、清热、排除毒素、促进血液循环。这些草药被认为具有抗癌特性，有助于减少肿瘤生长、缓解症状和改善整体健康状况。在之前的体外实验中，三棱佳神方可以抑制肝癌细胞的增殖¹⁵。然而，如何高效合理地评价中草药化合物对肝癌的抑制作用呢？通过建立 BALB/c-nu 小鼠原位肝癌模型，主要通过小动物活体成像和鸡胚绒毛膜尿囊膜试验研究三棱佳神方对肝癌和血管生成的抑制作用。

在吉林大学转化医学院动物实验中心饲喂无特异性病原体、5 周龄、体重 18-22 g 的 BALB/c-nu 雄性裸鼠;饲喂条件为 22 °C-24 °C，相对湿度为 40%-60%。实验动物许可证号为SYXK（Ji）2018-0006，实验过程符合吉林大学伦理委员会规章制度，动物伦理批准文号为20221228-01。

1.冻干三棱佳参方15的制备

1. 将 16 克三棱、16 克人参、8 克大黄和 2 克川蓉放入智能煎煮锅中（见 材料表），在 294 mL 去离子水中室温浸泡 30 分钟。加热煮沸后，继续在 100 °C 下煮 30 分钟，并通过双层医用纱布过滤液体（见 材料表）。向残留物中加入 252 mL 去离子水，在 100 °C 下煮 30 分钟，然后用双层纱布过滤液体。
2. 在干净的不锈钢培养皿中收集步骤 1.1 中的滤液，并在 -80 °C 下冷冻 12 小时（参见 材料表）。
3. 将步骤 1.2 中的三棱佳神配方放入真空冷冻干燥机中（见 材料表）（冷阱温度：-55°C）并干燥 48 小时，以获得三棱佳神配方的冻干粉。

2. 稳定表达荧光素酶 16 的 HCCLM3 细胞系的构建

1. 在 24 孔板（参见 材料表）中以 5 × 10⁵ 个细胞/孔加入 1.0 mL HCCLM3 细胞悬液，并在含有 3 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养基（10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素溶液 + DMEM）（参见 材料表）中培养 72 小时在细胞培养箱（37 °C，5% CO₂， 参见 材料表）。
2. 在步骤 2.1 中弃去细胞上清液，加入 100 μL 0.25% 胰蛋白酶溶液，在细胞培养箱中消化细胞 1 分钟（参见 材料表）。加入 300 μL 完全培养基，使用移液管释放贴壁细胞并终止消化。收集所有细胞悬液，并将它们置于 15 mL 离心管中，在室温下以 1,000 × g 放置 5 分钟。弃去上清液后，加入 1 mL 完全培养基并通过移液混合。
3. 将步骤 2.2 中 4 × 10 个³ HCCLM3 细胞/孔的 100 μL 细胞悬液添加到 96 孔板中，并在细胞培养箱中培养 24 小时（37 °C，5% CO₂，参见 材料表）。
4. 在步骤 2.3 中向 96 孔板中加入 0.27 μL GFP 慢病毒，并在细胞培养箱中培养 15 小时（37 °C，5% CO₂，参见 材料表）。弃去细胞上清液，加入 100 μL 完全培养基，并使用荧光显微镜在 488 nm 的激发波长和 507 nm 的发射波长下获取图像（参见 材料表）。
5. 更换 2 mL GFP 慢病毒并继续培养 24 小时。将 2 mL 不含 GFP 慢病毒的完全培养基再更换 24 小时。
   注：在倒置荧光显微镜下观察到 GFP 慢病毒转染 HCCLM3 细胞的效率为 80%。
6. 将步骤 2.1 中的 5 mL 2 × 10⁵ 细胞悬液加入 60 mm 培养皿中，并在细胞培养箱中培养 24 小时。加入 64.5 μL 荧光素酶，继续在细胞培养箱中培养 15 小时（37 °C，5% CO₂，参见 材料表）。
7. 弃去上清液，加入 5 mL 完全培养基继续培养，直到细胞在培养皿中达到 90% 汇合。弃去细胞上清液，用 2 x 1 mL PBS 洗涤，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液，在细胞培养箱中消化细胞 1 分钟（37 °C，5% CO₂，参见 材料表）。加入 3 mL 完全培养基，上下移液至游离贴壁细胞并终止消化。收集所有细胞悬液用于后续小鼠注射。
   注：为了获得足够数量的细胞，对细胞进行连续传代和培养。

3. BALB/c-nu 裸鼠肝癌 原位 模型的建立及治疗¹⁵

1. 在步骤 2.7 中加入 100 μL 1 ×^{10 7} 个转染荧光素酶的 HCCLM3 细胞和 100 μL 基质胶（参见 材料表）到 1.5 mL 离心管中（参见 材料表），并与 1 mL 移液器轻轻混合（参见 材料表）。
   注：溶液制备的整个过程必须在冰上进行，以防止基体胶固化。
2. 用碘平消毒BALB / c-nu裸鼠的左右腋窝（参见 材料表），并用酒精脱碘（参见 材料表）。
3. 用 1 mL 一次性注射器将 100 μL 步骤 3.1 中的 HCCLM3 细胞和基质胶的混合物缓慢注射到 BALB/c-nu 裸鼠的左右腋窝中。
   注：大约 10 天后，BALB/c-nu 裸鼠在双侧腋下注射部位出现约 0.5 cm³ 的肿瘤肿块。
4. 通过腹膜内注射 1%，50 mg/kg 戊巴比妥钠，在步骤 3.3 中麻醉 BALB/c-nu 裸鼠。用眼科剪刀和镊子切开双侧腋窝的皮肤（见 材料表），轻轻剥开皮下肿瘤块，将其放入含有预冷PBS缓冲液的细胞培养皿（见 材料表）中（见 材料表），并用手术刀将其切成1mm³ 块（见 材料表）。
   注意：必须在 0.5 小时内在冰上收获 BALB/c-nu 裸鼠的腋下肿瘤块，以维持肿瘤细胞活性并提高模型的成功率。采样结束时，通过去除颈椎杀死小鼠。如果肿瘤有坏死部分，则需要切除，只留下鱼白色肿瘤，以防止原位癌移植过程中的感染。
5. 用 1%，50 mg/kg 戊巴比妥钠腹膜内麻醉 BALB/c-nu 裸鼠（见 材料表），用碘消毒腹部（见 材料表），并用酒精脱碘（见 材料表）。
6. 用眼用剪刀和镊子（见 材料表）在剑突下方 0.5 cm 的位置切出约 1 cm 的 45° 手术切口，露出肝脏，轻轻按压肝脏挤出肝组织，用称重纸固定肝脏。
   注意：可以将棉签或棉棒放在小鼠的肋骨下，以有效地暴露肝脏。
7. 用 10 mL 一次性注射针在步骤 3.4 中取一小块肿瘤组织，将肿瘤块植入与肝脏平行约 0.5 cm 的肝脏中，将其固定在肝包膜下，缓慢拔针。
   注意：使用 1 mL 一次性注射器滴入 2 滴融化的基质胶，观察肿瘤肿块，无任何意外滑脱和无出血，然后缝合手术切口。
8. 用 12 厘米的针头固定镊子和 6-0 手术缝合线闭合手术切口（见 材料表）。将红霉素眼膏（ 材料 表）涂抹在手术部位以防止感染。将小鼠放在加热垫上（参见 材料表），并在醒来后将它们放在单独的笼子中。
9. 从建模后的第一天开始，从第 3.8 步开始，通过管饲法向小鼠施用 7.5 mg/kg 索拉非尼和三棱甲神配方（7.8 g/kg、15.6 g/kg 和 31.2 g/kg），持续 14 天，每天一次。向模型组中的小鼠施用等体积的生理盐水。

4. 体内 成像评估

注：在第 14 天，在给药结束后 1 小时进行实时成像。

1. 打开计算机和 活体 成像仪器的电源（参见 材料表）。双击桌面上的 Living Image 图标 以启动该程序。单击控制面板中的 initialize IVIS system（初始化 IVIS 系统 ）以启动整个 IVIS 系统。
   注意： 机器完成自检后，控制面板中的温度状态指示灯为红色。温度下降且指示灯变为绿色后等待约 5-10 分钟，即可进行图像采集。
2. 用酒精消毒小鼠的腹部，并用一次性注射器每克体重腹膜内注射 10 μL D-荧光素（参见 材料表）。通过腹膜内注射 1%，50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉小鼠。
   注：用无菌 PBS 将 D-荧光素稀释至 15 mg/mL。
3. 将步骤 4.3 中麻醉的小鼠放入观察箱并关上门，在控制面板中将曝光时间设置为 30 s： 模式选择：根据样本类型选择 发光 ，默认选择 自动程序 ，按 获取 获取图像。
4. 单击 保存 Living Image 数据，选择 所有 Living Image 数据文件，然后将其保存在计算机桌面上。
5. 单击主屏幕上的 Exit in Living image 。依次关闭相机电源、成像仪器电源和计算机电源。
6. 成像后，通过颈椎脱位对麻醉小鼠实施安乐死 （腹膜内注射 1%，50 mg/kg 戊巴比妥钠）。

5. 苏木精-伊红染色¹⁷

1. 将步骤 4.7 中小鼠的新鲜肝组织在 4% 多聚甲醛中固定 48 小时，然后用流水冲洗 3 次，每次 5 分钟以洗去多聚甲醛（参见 材料表）。
2. 在步骤 5.1 中，在 30% 乙醇、50% 乙醇、70% 乙醇、95% 乙醇 、95% 乙醇 和无水乙醇中依次脱水肝组织 1 小时（参见 材料表）。
3. 将脱水的肝组织依次放入步骤 5.2 至 50% 乙醇、50% 二甲苯、二甲苯 、二甲 苯和二甲苯 中，使其透明 1 小时（参见 材料表）。
   注意：二甲苯易挥发且有毒，此步骤在通风橱中进行。
4. 熔化石蜡，保持温度在 55 °C 左右。 将步骤 5.3 中的肝组织块放入装有蜡溶液的石蜡包埋机（参见 材料表）中进行包埋。
5. 在石蜡切片机上固定步骤 5.4 中嵌入的小鼠肝组织蜡块（参见 材料表），将其切成 5 μm 厚的切片，将切片完全平放在 50 °C 水中，然后用载玻片舀起。最后将它们放入生物组织烘烤机中，在 70 °C 下干燥 20 分钟（参见 材料表）。
6. 将步骤 5.5 中的 5 μm 切片依次浸泡在二甲苯 、二甲苯 、无水乙醇 和无水乙醇 中 10 分钟，然后分别在 95% 乙醇、90% 乙醇、80% 乙醇和 70% 乙醇中浸泡 5 分钟，最后用蒸馏水洗涤进行脱蜡处理（见 材料表）。
7. 用苏木精将脱水的 5 μm 厚的 parrafin 蜡肝组织切片染色 8 分钟，然后用流水冲洗。
8. 在 1% 盐酸溶液中分化 10 秒，然后用流水冲洗 30 分钟（参见 材料表）。
9. 用 0.5% 伊红溶液染料 1 分钟（参见 材料表）。
10. 将切片放入 95% 酒精 、 95% 酒精 、 无水乙醇 、 无水乙醇 、 二甲苯 和 二甲苯 中各 5 分钟以脱水（见 材料表）。
11. 用中性胶密封，并在倒置光学显微镜下拍照（参见 材料表）。

6. 免疫组化染色¹⁸

1. 在步骤 5.6 中，将 1.5% H₂O₂ 滴到小鼠肝脏的 5 μm 切片上，并在室温下孵育 10 分钟，然后用 PBS 洗涤 2 x 5 分钟（参见 材料表）。
2. 用柠檬酸溶液（参见 材料表）修复组织 5 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
3. 在室温下与 0.2% triton X-100（参见 材料表）孵育 4 分钟，然后在室温下与 0.5% triton X-100 孵育 4 分钟，并用 PBS 洗涤。
4. 加入山羊血清（参见 材料表）密封 15 分钟，然后加入用 PBS （1：300） 稀释的 ki67 一抗（参见 材料表）在 4 °C 下孵育过夜。用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
5. 与用 PBS （1：200） 稀释的二抗在室温下孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟（参见 材料表）。
6. 用显影液染色 5 分钟，然后用双蒸水冲洗（参见 材料表）。
7. 用苏木精重新染色 2 分钟，在 1% 盐酸溶液中分化 10 秒，然后用流水冲洗 30 分钟（参见 材料表）。
8. 将切片放入 95% 酒精 、 95% 酒精 、 无水乙醇 、 无水乙醇 、 二甲苯 和 二甲苯 中各 5 分钟以脱水（见 材料表）。
9. 用中性胶密封并在倒置光学显微镜下拍照（参见 材料表）。

7. 雏鸡胚胎绒毛膜尿囊膜试验¹⁹

1. 将白羽毛鸡蛋（参见 材料表）在室温下放置 2 小时，并喷洒酒精消毒。用颅骨钻在气室上钻一个孔（参见 材料表），并在气室中孵育鸡蛋 7 天（孵化温度 37.8-38.2 °C，相对湿度 65%）。
   注意：在孵化的前 3 天，自动种蛋翻转按钮打开，以防止雏鸡胚胎绒毛膜尿囊膜粘附在壳上并形成假气室。
2. 丢弃鸡蛋照明器中的弱/未受精的鸡蛋（参见 材料表）。用颅骨钻头在假气室上钻孔后，用眼镊小心地剥出 1 x 1 厘米的窗口（见 材料表）（见 材料表）。
   注意：请注意，蛋壳不应落入雏鸡胚胎绒毛膜尿囊膜中。
3. 在孵育的第 8 天，向假气室中的每个鸡蛋中添加 100 μL 肿瘤细胞悬液（1 × 10⁶ 个细胞），对照组除外。在药物组中，添加 100 μL 索拉非尼溶液和三棱佳神配方。在对照组和模型组中，添加 100 μL PBS。
   注：肿瘤细胞悬液由等体积的 HCCLM3 细胞和基质胶组成。药物浓度设定如下：7.5 mg/kg 索拉非尼和三棱佳神方（7.8 g/kg、15.6 g/kg 和 31.2 g/kg）。
4. 用透明敷料盖住窗户（见 材料表），并用酒精喷雾消毒（见 材料表）。孵育 7 天后，取出透明敷料，从假气室中加入 1 mL 固定剂（甲醇：丙酮 = 1：1）（参见 材料表）固定 30 分钟。
5. 用 1 mL 注射器丢弃固定剂。用眼科剪刀在假气室中剪下 ~5 x 5 cm 绒毛膜尿囊膜，并放入 60 mm 培养皿中。
   注意：对于带血的雏鸡胚胎绒毛膜尿囊膜，请用 PBS 冲洗。对于附着在组织的雏鸡胚胎绒毛膜尿囊膜，用眼科剪刀分开。
6. 将步骤 7.5 中的绒毛膜尿囊膜置于光学显微镜下并拍摄血管（参见 材料表）。

如图 2A 所示，我们建立了 BALB/c-nu 小鼠的 原位 肝癌模型，并评价了三棱甲神方的抗肿瘤效果。 图 2B 表明 Sanleng Jiashen 公式可以显着抑制肝脏肿瘤的生长。病理结果显示，与对照组相比，模型组肿瘤病灶与周围组织边界清晰，肿瘤病灶较大，结节扩大，压迫生长。同时，肿瘤组织中肿瘤细胞的排列无序，无肝小叶结构。...

大量证据证实，三棱家参方中的三棱、人参、大黄、川芎对肝癌的治疗具有药理作用。研究表明，三棱能显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长，防止肿瘤细胞侵袭和转移，诱导细胞凋亡，调节细胞周期和肿瘤微环境²⁰。事实证明，三棱中的活性成分山奈酚可以通过抑制增殖、促进自噬和调节氧化应激来抑制胃癌²¹、前列腺癌²²

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了中国哲学社会科学基金 （20VYJ070）、吉林省教育厅项目 （JJKH20230963KJ） 和长春中医药大学第二批杏林学者工程项目 （QNKXJ2-2021+ZR25） 的支持。