使用高压氧提高人 U251 神经胶质瘤细胞的放射敏感性

该方案表明，高压氧可以通过阻断 G2/M 期的细胞来增强经 X 射线照射处理的 U251 神经胶质瘤细胞的增殖抑制和凋亡。这提高了人神经胶质瘤细胞系的放射敏感性。

本研究的目的是探索利用高压氧增强人神经胶质瘤细胞的放射敏感性。将传代培养的 U251 人神经胶质瘤细胞随机分为四组：未处理的对照组、仅用高压氧 （HBO） 处理的细胞、仅用 X 射线照射 （X-ray） 处理的细胞以及用 HBO 和 X 射线处理的细胞。在这些组中观察细胞形态、细胞增殖活性、细胞周期分布和细胞凋亡，以评价 HBO 在改善胶质瘤细胞放射敏感性中的作用。随着 X 线剂量 （0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy） 的增加，胶质瘤细胞的存活分数 （SF） 逐渐降低。

在每种剂量下，用 HBO 和 X 射线一起处理的细胞观察到的 SF 显着低于 X 射线组 （均 P < 0.05）。对于U251细胞系，HBO联合X线组各剂量的增殖抑制显著高于X线组（均 P 均<0.05）。HBO 联合 X 线 （2 Gy） 组 （26.70% ± 2.46%） 和 HBO 组 （22.36% ± 0.91%） G2/M 期细胞百分比显著高于对照组 （11.56% ± 2.01%） 和 X 线 （2 Gy） 组 （10.35% ± 2.69% （均 P < 0.05）。HBO 联合 X 线组 （2 Gy） 组 U251 细胞凋亡显著高于 HBO 组、 X 线 （2 Gy） 组和对照组 （ 均 P < 0.05）。我们得出结论，HBO 可以通过阻断 G2/M 期的胶质瘤细胞来增强胶质瘤 U251 细胞的增殖抑制和凋亡，并提高 U251 胶质瘤细胞的放射敏感性。

神经胶质瘤是一种原发性颅内肿瘤，起源于中枢神经系统神经胶质细胞¹。目前神经胶质瘤的治疗策略是手术联合放疗和化疗。胶质瘤的术后放疗可提供生存益处（I 级证据），术后早期放疗可有效延长患者生存期（II 级证据）²。对于更高级别的胶质瘤（III 级或 IV 级），尤其是高度恶性和侵袭性胶质母细胞瘤（III 级证据）³，应尽早进行术后放疗（<6 周）。然而，尽管进行了早期干预，但胶质瘤在综合治疗后仍具有较高的复发率和不良的预后。这些结果主要与神经胶质瘤的低放射敏感性有关。与肿瘤放射敏感性相关的因素包括肿瘤细胞固有的放射敏感性、缺氧或非缺氧肿瘤细胞、缺氧肿瘤细胞的比例以及瘤周组织修复辐射损伤的能力⁴。

在这些因素中，缺氧或非缺氧肿瘤细胞以及缺氧肿瘤细胞的比例对肿瘤放射敏感性有重要影响。高压氧 （HBO） 可以通过增加组织氧分压和血氧扩散来改善组织储氧。HBO 还可能产生一系列有益的生化、细胞学和生理效应⁵。例如，HBO 对放疗诱导的辐射损伤具有显著的修复作用。尽管据报道 HBO 联合放疗或化疗可以提高放疗或化疗对神经胶质瘤⁶ 的临床疗效，但关于单独使用 HBO 如何影响恶性神经胶质瘤的生长存在相当大的争论。Ding 等人⁷ 和 Wang 等人⁸ 都证明 HBO 通过抑制细胞凋亡和促进肿瘤血管生成的机制促进小鼠原位胶质瘤的生长。据报道，在生理条件下，HBO 通过诱导氧化应激来促进肿瘤血管生成⁹。

然而，一项研究表明，短期 HBO 暴露会促进肿瘤细胞增殖，而长期 HBO 暴露会促进细胞凋亡并抑制增殖¹⁰。因此，需要进一步的研究来探讨 HBO 是否促进或抑制胶质瘤的生长，以及 HBO 联合放疗或化疗如何诱导治疗致敏。特别是，需要有关 HBO 如何改善神经胶质瘤放射敏感性的机制细节。为了探讨 HBO 如何提高人 U251 胶质瘤细胞的放射敏感性，本研究使用 HBO 联合 X 射线照射对胶质瘤细胞增殖的影响，并观察对细胞周期分布和细胞凋亡的影响。

所有研究方法均经兰州大学附属第二医院机构评审委员会和伦理委员会批准，并按照相关指南和规定进行。

1. 胶质瘤细胞的治疗

注意：本实验中使用了 U251 神经胶质瘤细胞系。

1. U251 细胞培养
   1. 将 U251 细胞接种在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM 的多个培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养。
   2. 达到 50%-60% 汇合度后，使用胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%，不含酚红）解离细胞，然后让它们生长至 80% 汇合度。
2. X 射线照射
   1. 用最大 1 cm 厚的等效组织补偿器覆盖培养板或培养瓶。然后，将细胞暴露于由源池距离为 100 cm 的 6 MV 直线加速器发射的 X 射线照射下，通过单击遥控板上的 旋转 按钮进行调整。
   2. 让物理学家测量辐射剂量并校正衰减。作为对照，在 X 射线照射前将含有培养基的烧瓶放入检测器中。
3. 高压氧 （HBO）
   1. 通过打开紫外线 15 分钟对 HBO 室进行消毒，然后用 0.02 MPa 的纯氧浸润 5 分钟。
   2. 将细胞放入腔室中的板或培养瓶中后，单击腔室外控制板上的压力 调节器 按钮，在照射后 30 分钟内将腔室中的 HBO 压力增加到 0.2 MPa （2.0 ATA）。
   3. 30 分钟后，单击 压力调节 器按钮，将 HBO 压力降低到之前的压力水平 （0.1 MPpa）。然后，每天用 1x HBO 处理培养瓶或板，连续 3 天。

2. 不同组的 U251 胶质瘤细胞

1. 设置对照组、X 射线 （2 Gy） 组和 HBO 与 X 射线 （2 Gy） 组的组合，以计算细胞生长曲线。
2. 从神经胶质瘤 U251 细胞中制备单细胞悬液，显示最大生长速率（参见步骤 1.1.2）。通过使用血细胞计数器载玻片计数细胞，将细胞密度调节至 1 × 10⁶/mL。随后，将 1 mL 细胞悬液加入培养瓶中（细胞密度：1 × 10⁶/瓶），每组有三个单独的瓶子。
3. 用明场显微镜以 100 倍放大倍率评估细胞形态，以计数培养 24 小时、48 小时和 72 小时的贴壁细胞。

3. HBO 后 30 分钟内 U251 神经胶质瘤细胞的放射敏感性（克隆形成试验）

1. 在 6 孔板中以 5 ×^{10 2} 个细胞/mL 的浓度将 U251 单细胞悬液接种在整个孔中，然后将它们暴露于指定剂量的 X 射线照射（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy 和 8 Gy），每个 X 射线剂量检查三个平行样品。
2. 对于 HBO 联合 X 射线 （2 Gy） 组，在 HBO 处理后 30 分钟内将细胞暴露于 X 射线照射下。处理后，在 37 °C 和 5% CO₂ 下将细胞培养 14 天。
3. 看到克隆后，去除培养基并用 PBS 洗涤克隆 2 次。
4. 将细胞固定在 1 mL 10% 甲醇中 15 分钟，然后用 1 mL 0.1% 结晶紫染色 20 分钟。
5. 染色后，用移液管用 6 mL 蒸馏水洗涤细胞，然后吸出结晶紫溶液。让细胞风干。
6. 在显微镜下对直径在 0.3 mm 和 1.0 mm 之间的克隆进行计数，以确保每个克隆有 >50 个细胞。
7. 使用等式 （1） 计算存活分数 （SF）：
   SF = × 100% （1）
8. 使用统计软件，使用公式 （2） 基于单次打击多目标 （SHMT） 模型生成辐射剂量-生存曲线：
   S = 1 - （1 - ）^N （2）
   其中 S = 生存概率; k = 平均致死剂量（每个细胞平均造成 1 次命中的剂量）; x = 每个单元格的点击数;N = 靶标数量（细胞死亡的命中次数）。
9. 计算放射生物学参数，包括平均致死剂量 （D₀）、准阈值剂量 （Dq）、外推数 （N）、照射剂量为 2 Gy 时的存活分数 （SF₂）、增敏比 （D₀）（对照组 SER = D₀ /实验组 D₀ ）和 SER （Dq） （SER = Dq 对照组/实验组 Dq），以评价 HBO 对 U251 胶质瘤细胞放射敏感性的影响。
   其中 D₀ = 生存曲线线性部分斜率的倒数（剂量使存活率降低 63%）
   N = 通过外推线性部分以满足纵坐标而形成的交点的值（反映细胞修复辐射引起的损伤的能力）
   Dq = 横坐标上的交点投影点的值，与横坐标平行于横坐标的 1.0 线与外推线相交而形成的交点。

4. 评估 U251 神经胶质瘤细胞增殖的细胞计数试验

1. 设置对照组、HBO 组和单独或与 HBO 联合使用 X 射线处理的组（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）。
2. 在单细胞悬液中使用 U251 细胞将细胞密度调节至 1 × 10⁴ 个细胞/mL。
3. 将细胞悬液（100 μL，密度：1 × 10³/孔）接种在 96 孔板（每组 5 个孔）中。进行细胞计数测定（参见 材料表），然后在用试剂培养 48 小时后，使用酶标仪测定 450 nm 处的光密度 （OD）。
4. 根据等式 （3） 计算细胞增殖抑制率 （IR）：
   红外线 = × 100% （3）

5. 检测 U251 神经胶质瘤细胞凋亡

1. 设置对照、HBO、X 射线 （2 Gy） 和 HBO 结合 X 射线 （2 Gy） 组。
2. 培养后取出培养基，并用 1x PBS 洗涤细胞。
3. 在显微镜下观察到圆形细胞形态时，用胰蛋白酶分离细胞，然后通过添加 DMEM 使胰蛋白酶失活。
4. 将细胞转移到离心管中，并以 200 × g 离心 5 分钟。
5. 弃去上清液，向沉淀中加入 3 mL 的 1x PBS，然后轻轻移液以重悬细胞。
6. 再次以 200 × g 离心细胞 5 分钟。然后，吸出上清液 PBS 并洗涤细胞 2 次，然后在 50 μL 结合缓冲液中轻轻移液重悬。
7. 在 4 °C 下向细胞中加入 5 μL 膜联蛋白 V-FITC，并在 4 °C 下避光孵育细胞 15 分钟，然后加入 400 μL 结合缓冲液。将混合物转移至含有 5 μL 碘化丙啶 （PI） 染料溶液 （10 mg/mL） 的流式细胞仪管中。5 分钟后通过流式细胞术检测凋亡细胞¹¹。
8. 记录 488 nm 激发波处的红色荧光，输入计算机以分析 5,000 个细胞中每个细胞周期的百分比，然后打印凋亡细胞的峰值。
9. 通过膜联蛋白 V 和 PI 双标记收集红色和绿色荧光，输入计算机进行分析，然后打印点图。

6. 检测 U251 胶质瘤细胞周期分布

1. 在用胰蛋白酶处理上述细胞之前，用 1 mL PBS 洗涤上述细胞 2 次。
2. 当通过光学显微镜检测到圆形细胞形态时，添加含有 10% FBS 的 DMEM。
3. 在室温下以 200 × g 离心细胞 5 分钟。
4. 去除上清液，将这些细胞重悬于 1 mL PBS 中，然后加入预冷的 75% 乙醇溶液。
5. 将混合物在 -20 °C 下孵育至少 4 小时或过夜。
6. 用冰冷的 PBS 和 180 μL EDTA（0.1 mM，3.7 mg EDTA + 100 mL PBS）、20 μL RNase A （10 mg/mL）、35 μL Triton X-100（2%，2 mL Triton + 98 mL FBS）和 96.5 μL PBS 洗涤细胞 2 次。然后，加入 17.5 μL 的 PI 溶液 （1 mg/mL）。
7. 将混合物在 4 °C 下避光孵育 10 分钟。
8. 用 200 μL PBS 洗涤细胞，然后将它们放入流式细胞仪中以评估细胞周期分布，如前所述¹²。
9. 在双激光三维空间激发模式下作流式细胞仪，光斑尺寸为 22 μm x 66 μm 和 13 μm x 66 μm。使用 430 μm x 180 μm 的流动室、300-1,100 nm 光谱、≤100 MESF 的可检测性和 CV <2% 的分辨率。然后，将细胞暴露在 488 nm 激发光下，并使用仪器软件检测和测量荧光信号以确定细胞周期分布¹³。
10. 测定 DNA 含量，然后根据 DNA 含量，分析细胞周期。

7. 统计分析

1. 执行统计分析。
2. 将数据表示为平均值±标准差。
3. 使用学生 t 检验比较各组，统计显著性设置为 P < 0.05。

U251 神经胶质瘤细胞的培养
在 DMEM 中培养后 24 h 至 48 h ，U251 神经胶质瘤细胞呈梭形，并且粘附。这些细胞用于进一步研究（图 1）。

胶质瘤细胞形态和计数
细胞培养 24 h、48 h 和 72 h 后，HBO 联合 X 射线 （2 Gy） 组 U251 神经胶质瘤细胞计数显著低于 X 射线 （2 Gy） 组 （均 P < 0.05）（表 1...

胶质瘤细胞系 U251 是最经典的人类神经胶质瘤细胞系之一，在许多研究中被广泛用作胶质瘤模型。

HBO 对 U251 胶质瘤细胞增殖的影响
HBO 通常是指在压力比正常大气压高 1.5-3 倍的密封室中呼吸纯氧（100% 氧气浓度），这会增加微血管血浆中的氧含量¹⁴。据报道，对于神经胶质瘤患者，放疗或化疗与 HBO 相结合可以提高这?...

作者没有需要声明的利益冲突。

没有。