使用三维快速力映射可视化固液界面处的溶液结构

在这里，我们提出了一种使用三维快速力映射的协议 - 一种原子力显微镜技术 - 通过映射界面区域内的针尖-样品相互作用，以亚纳米分辨率可视化固液界面处的溶液结构。

各种研究领域面临的挑战包括固液界面的可视化，以及了解它们如何受到溶液条件（如离子浓度、pH、配体和痕量添加剂）以及潜在的晶体学和化学的影响。在这种情况下，三维快速力映射 （3D FFM） 已成为研究界面处解结构的一种很有前途的工具。此功能基于原子力显微镜 （AFM），允许以亚纳米分辨率在三个空间维度上直接可视化界面区域。在这里，我们提供了用于获取 3D FFM 数据的实验方案的详细说明。讨论了根据样品和应用优化作参数的主要考虑因素。此外，还讨论了数据处理和分析的基本方法，包括将测量的仪器可观测值转换为可以链接到局部解结构的尖端样本力图。最后，我们阐明了与 3D FFM 数据解释相关的一些悬而未决的问题，以及该技术如何成为表面科学的核心工具。

在固液界面的几纳米范围内发生了许多有趣的现象，经典的胶体相互作用理论在这些现象中被分解了¹。溶剂分子和离子组织成意想不到的模式² 和不同的过程，例如催化³、离子吸附 ^4,5、电子转移 ^6,7、生物分子组装 ⁸、粒子聚集⁹、附着^10,11 和组装^12,13，可能会发生。然而，很少有技术可以表征界面处的溶液结构，尤其是在亚纳米 3D 分辨率下。在此背景下，三维快速力映射 （3D FFM） - 一种基于原子力显微镜 （AFM） 的技术 - 已成为确定界面溶液结构^14,15 并了解其对此类现象的影响的有用工具。

通常，AFM 技术使用带有纳米尺寸尖端的悬臂来使用两大类测量来表征表面：地形成像，测量每个 xy 像素处基板的高度，或量化机械性能、胶体相互作用^16,17 或功能化探针和基板之间的粘附力的力测量。今天，这种多功能仪器的功能远远超出了这些传统应用;熟练的用户作现代仪器可以通过将力显微镜与光谱学和其他方法相结合来测量电、磁和化学表面特性¹⁸。也许最令人着迷的进步是能够以纳米级空间分辨率对原生解决方案中的材料和过程进行实时成像 19,20,21。后一种功能促进了 3D FFM 的发展，通过将 1D 力曲线与地形成像相结合，将 AFM 测量扩展到第三个空间维度¹⁴。具体来说，针尖在每个 xy 坐标处获取连续的力曲线，以生成针尖在固液界面处检测到的力的 3D 图。这里的新颖之处在于，足够快速和灵敏的探针可以检测与分子局部分布相对应的微小力梯度，以绘制界面溶液结构。

迄今为止，只有少数研究小组开发了 3D FFM，在我们看来，这不是由于其技术限制，而是需要内部定制仪器来执行这些测量。然而，3D FFM 最近才商业化，现在所有相关学科的研究人员都可以使用。从科学的角度来看，这项技术具有广泛和多学科的吸引力。例如，第一个 3D FFM 实验是在矿物溶液系统 15,22,23,24 上进行的，其中重要的问题包括理解晶体生长和溶解的机制、离子和分子的吸附以及水合层在颗粒聚集和附着中的作用。成功的实验已经确定了白云石晶格²⁵ 中的钙和镁原子，可视化了方解石点缺陷周围的溶液结构²⁶，并对云母^27,28 和萤石^24,29 表面的离子吸附进行了成像。

除了可视化矿物-溶液界面外，3D FFM 还可以深入了解表面和胶体物理学中的基本问题，例如短程胶体相互作用的缩放、分子水平上双电层的结构以及溶剂化力的性质和来源。这些测量对电化学和电池研究具有重要意义，因为 3D FFM 可以映射电极-电解质界面并探测它们对电场的响应³。材料科学中的其他应用包括了解分离膜、非均相催化剂和聚合物涂层表面发生的现象。随着这种能力的进一步发展，我们预计它也将在生物分子成像和描述相互作用、离子和溶剂分子在其自组装中的作用方面发挥重要作用。

在 3D FFM 中推进数据解释的关键方面之一是与以前用于研究固液界面的其他实验和仿真工具进行基准测试。例如，基于 X 射线反射率或衍射的技术测量电子密度分布，这些电子密度分布可以映射到离子和溶剂分子的分布，作为界面高度^30,31,32,33 的函数。这种方法在一系列矿物溶液系统中取得了成功，但仍然局限于大型原子光滑表面，并且通常无法产生横向分辨数据。其他技术，如和频产生光谱，提供了矿物表面溶剂结构特定方面的证据，如溶剂分子在表面的取向，但不能直接观察结构^34,35。此外，分子动力学模拟已经取得了显著进步，现在可以常规探测晶体表面的溶剂分布曲线 4,36,37,38,39。虽然这些技术中的每一种都有自己的挑战和局限性，但它们构成了一套互补的工具，用于研究界面溶液结构;3D FFM 有望在这方面做出重大贡献，并扩大可以研究的固液系统的范围，以及可以回答的研究问题。

在特定样品上实施 3D FFM 的先决条件是能够获得具有所需空间分辨率的地形图像。有关高分辨率 AFM 成像的详细实验方案，读者可以参考 Miller 等人最近的手稿²⁰。为了实现 3D FFM 的最佳运行，强烈建议首先掌握其中描述的高分辨率成像技术。该协议中的大多数建议对于 3D FFM 都是适用和必要的。在以下协议中，我们简要强调了高分辨率成像的主要步骤，但重点介绍了 3D FFM 的具体注意事项。

1. 加载和校准 AFM 针尖

1. 将悬臂尖端连续浸入水和异丙醇溶剂中几分钟，以去除污染物和有机吸附物，以清洁悬臂尖端。其他常见的清洁方法包括氩等离子体或紫外线臭氧表面处理。
   注：在比较不同的数据集时，样品和悬臂制备要保持一致。清洁过程的变化可能会影响尖端特性，例如表面化学性质、亲水性甚至形状，从而影响测量的力⁴⁰.
2. 也要用水和异丙醇溶剂清洁悬臂支架。
3. 使用支架夹或螺钉将悬臂加载到支架中，就像使用的 AFM 仪器的典型情况一样。将悬臂支架连接到 AFM。
4. 使用 AFM 软件将激光点对准针尖以最大化响应信号，然后将偏转信号归零。
5. 测量悬臂弹簧在空气中的常数。在大多数现代显微镜上，通过记录悬臂的热波动并将第一个谐振峰拟合到按照制造商协议执行的简单谐振子模型，可以自动执行此步骤。
   注意：在某些 AFM 应用中，测量弹簧常数经常被忽视，但对于正确解释 3D FFM 数据至关重要，特别是对于将来自仪器可观察数据的数据转换为测量的力，如后面的部分所述。

2. 加载基材和溶液

1. 断开并从 AFM 载物台上取下悬臂支架，并在悬臂尖端上添加 ~60 μL 成像溶液。确保吸头完全浸入溶液中。在此过程中注意避免产生气泡。
   注意：成像解决方案可以是与科学调查相关的任何内容。作为测试溶液，使用 [KCl] = 10 mM 甚至纯水。
2. 在测量之前立即劈开样品（例如云母），以获得光滑干净的表面。用成像溶液冲洗样品，然后在样品表面添加 ~100 μL 相同的成像溶液。
   1. 将清洁后的底物放在样品台上。底物尺寸因实验而异;它可以大到 1 x 1 cm² 的晶圆，也可以小到沉积在表面上的纳米颗粒。
      注意：与任何其他 AFM 测量一样，拥有干净的表面对于获得可靠的 3D 数据非常重要，因为界面对有机物和其他残留物的污染特别敏感²⁷。
3. 将悬臂支架返回并固定在载物台上的位置。小心地降低悬臂位置，直到溶液液滴落在尖端上，样品接触。采样台由仪器软件或仪器主体上的物理旋钮控制。
4. 让样品表面化学平衡并与成像溶液交换离子约 10 分钟。
   1. 作为可选步骤，取下悬臂尖端，用新鲜的等分试样更换成像溶液，放回悬臂支架，然后接近样品，直到尖端再次浸入溶液中。

3. 设置调幅 AFM 测量的仪器参数

1. 当吸头浸入溶液中时，获取另一个热图。此时，确保弹簧常数固定在步骤 1.5 中计算的值，同时使用仪器参数（例如 AmpInVOLS 参数）来拟合热峰值。同样，在大多数现代显微镜上，只需在仪器软件的热图部分下单击几下即可自动执行此步骤。
   注意：该参数校准仪器检测到的电子信号与针尖-样品距离（以纳米值为单位）的转换，以便实验人员可以获得针尖位置和偏转的可靠数据。
2. 通过将驱动频率 （ν_exc） 设置为谐振频率 （ν_e） 来调整悬臂尖端，然后将相移居中以接近谐振频率的 90° 为中心。这些是用户在调幅模式下作仪器时可以使用制造商的协议来控制的仪器参数。
   注意：一些 AFM 仪器使用光热激发，其共振频率与步骤 3.1 中获得的值相同。这种尖端激励方法对于 3D 力映射非常有利，因为它允许稳定的成像条件，即使在非常低的驱动幅度下也是如此。
3. 找到样品表面的大致高度，然后小心地接近尖端，直到它与表面接触。为此，请使用仪器软件中的 Set Point（设定点 ）参数将设定点振幅更改为自由振幅的大约 ~70%。当尖端接近表面时，振幅下降，直到达到设定值，从而确定与表面啮合。
4. 从距表面 ~200 nm 的距离开始获取单个力曲线。通常，这是在仪器软件的 Force （力） 面板中完成的。在拔出尖端之前，按照步骤 3.2 所示，重新调谐并将相移居中 90°。由于针尖与表面的相互作用，谐振频率会略有降低。
   注意：此步骤可确保在随后的 3D FFM 测量期间，缩回尖端位置的相移约为 90 度。
5. 将设置的振幅更改为自由振幅的 ~70%。不要使用非常低的设定值（较大的施加力），因为这可能会过早地损坏尖端。
6. 获取地形图像。对于云母等光滑表面，从 ~20 x 20 nm² 图像开始。对于较粗糙的表面，首先对较大的区域进行成像，然后快速找到原子平滑的 20 x 20 nm² 区域进行成像。仔细检查采集的图像。此时，2D 成像分辨率至少应等于所需的 3D 力映射分辨率。
   注意： 应注意尽量减少尖端造成的损坏。例如，在对大面积和粗糙区域进行成像时，不要拍摄超过需要的图像，并使用平缓的设定点、较大的成像增益和低扫描速率。
7. 使用仪器软件，将 驱动振幅 降低到大约 0.25 nm，并在可能的情况下降低。相应地降低 Set Point 以始终小于驱动幅度和 Acquire test images 。 通过适当选择针尖和成像条件，驱动振幅可以降低到 ~0.1 nm。但是，在粗糙的表面地形上以如此小的振幅成像可能会损坏尖端时，请非常小心。
   注意：为了获得更好的垂直分辨率，驱动幅度应小于尝试解析的解特征。实际可以达到的最小自由振幅受与悬臂和仪器设置相关的热噪声的限制。通过分析与基线噪声相比的峰值幅度，可以在调整悬臂时定性评估信噪比。
8. 从 200 nm 的针尖-样品距离开始采集单力曲线。随后，将力曲线的针尖-样品距离减小到 50 nm、10 nm，最后减小到 5 nm。
   注意：优化测量条件，使缩回尖端位置的振幅尽可能低 （< 0.25 nm）;缩回尖端位置的相移为 ~90°;激励频率 （ν_EXC） 等于或非常接近谐振频率 （ν_E），这简化了仪器可观测物在后续步骤中转换为测量力的过程;并且设定值足够低，因此在力测量的最后几纳米内，相移（和振幅）显着下降（~40-50%）。施加的力可以进一步增加（设定值降低）。权衡是在此过程中，尖端会更快地损坏。
9. 确保在停止力曲线采集后撤回尖端。如果尖端保持啮合并靠近表面，它可能会漂移到表面并撞到表面。
   注： 图 1 绘制了在 [NaCl] = 10 mM 溶液中采集的白云母-水系统的 1D 力曲线，特别是相位 （φ）、振幅 （A） 和偏转 （δ） 响应。在此阶段，这些剖面应显示 3D 图中针对的特征的证据，并表现为振荡特征，这些特征在相位曲线中最为明显。请注意，此原始数据的高度坐标是任意的。有关数据处理和分析的更多详细信息，将在后面的部分中提供。

4. 获取 3D 力图

注：找到 3D FFM 测量的最佳参数将取决于样品表面、悬臂尖端和成像解决方案。提供了一般指南作为起点，但每个样品的适当参数需要获取和分析具有各种测量条件的数据集。以下步骤显示了如何获取矿泉水系统的 3D 力图。步骤 4.2 中描述的所有参数均使用仪器软件进行设置。

1. 执行第 2 节和第 3 节中所述的所有步骤。
2. 将针尖-样品距离 （z） 设置为 2-5 nm。由于尖端靠近表面，因此此距离足以解析界面溶液特征，并且还允许尖端在缩回到最远位置时与本体溶液平衡4.3。
3. 将 扫描区域 设置为 3 x 3 nm² 或 10 x 10 nm²， 分辨率 为 64 x 64 像素² -128 x 128 像素²。
   注意：其他应用（如生物分子成像）可能需要在所有三个空间维度上更大的扫描尺寸。
4. 将 Rate of Force Curve Acquisition 设置为 200-800 Hz，相当于每个 3D 数据集 15-120 秒。理想情况下，尽可能减少此数字，以最大程度地减少针尖的图像失真和热漂移，同时在 z 方向上保持适当的分辨率。对于这些扫描速率和尺寸，处理数据后在 z 方向上获得 50-100 像素/纳米，这通常足以解析界面溶液结构。
5. 作为起点，为 Set Point （设定点 ） 选择一个值，以便相移在每条力曲线中通常下降到 ~50-60°。设定点可以定义为低至自由振幅的 50%。但是，这尤其取决于被测样品的类型，并且需要反复试验。例如，在软分子的情况下，使用低设定点（高压）会损坏尖端或使表面变形。另一方面，高设定点（低压）可能不足以穿透和探测水合层。
6. 验证软件是否记录了分析调幅 AFM 数据所需的四个关键可观察对象：针尖高度、振幅、相位和偏转。请注意，根据仪器和软件的不同，可能存在多个数据通道用于跟踪针尖高度。由于 3D FFM 需要非常高的分辨率，因此使用最平滑的尖端高度轮廓和来自仪器的重叠电子噪声最少非常重要。除了记录这些关键变量之外，还需要其他作参数和元数据来分析和重建施加在尖端上的力（通常默认保存到您的数据文件中），如后面的部分所述。
   注意：3D FFM 已在调幅和调频 AFM 模式下得到验证。在数据质量和分析方面，这两种方法是等效的。因此，首选的作模式由实验者的判断和经验决定。幅度调制模式的一个可能优点是针尖在较大 z 距离上的稳定性，允许用户获得延伸到溶液中 >10 nm 的 3D 数据。相比之下，这种模式的一个缺点是以比悬臂运动慢的弛豫时间尺度对软分子进行成像。后一种应用为 FFM 提供了研究软材料和粘性液体中的界面弛豫的机会。在这些情况下，测得的波幅分布可能在接近和缩回循环中显示滞后，这给实际针尖高度带来了不确定性。

5. 处理 3D 力图数据

注意：以下步骤可以在首选的数据分析软件中使用内部生成的代码或使用 支持信息中提供的数据处理文件来执行。

1. 将原始数据加载到首选的分析软件中，以进行计算和可视化。
   注：分析所需的可观察对象是振幅 （A）、相移 （φ） 和针尖偏转 （δ） 作为高度位移 （z） 的函数，以及针尖属性，例如谐振频率 （ν_e）、弹簧常数 （k） 和品质因数 （Q）。其他作参数包括扫描尺寸、扫描速率、针尖激发频率 （ν_exc） 和驱动振幅 （A₀）。后一个值通常以电压单位记录，但可以根据步骤 3.1 中获得的校准值轻松转换为纳米。
2. 通过记录尖端在每个 xy 坐标处的最远高度位移，从 3D 数据集中提取等效的地形图像。使用此数据，通过在 x 和 y 扫描方向上将直线拟合到平均高度剖面来计算样品倾斜度。即使表面在原子上是光滑的，例如云母，预计样品也会倾斜几度，并且在数据分析之前应考虑相应的高度斜率。
   注：在大多数现代仪器上，此步骤对于常规地形成像是自动进行的，但对于 3D FFM 数据，应手动完成。显然，如果用户测量更复杂的表面，例如具有多级边缘的晶体，则应对这种方法进行轻微调整。
3. 线性化高度位移剖面。回想一下，3D FFM 中的尖端在每个进近和缩回周期中都遵循相似的正弦轨迹。然而，尖端的最远范围取决于它落在哪个晶体学位置，并且记录的尖端高度显然与最后一个有效数字不同。因此，在所有尖端轨迹中测量的高度值被离散化，以获得所有力曲线的单个线性 z 轮廓。
   注意：bin 大小取决于测量参数和感兴趣特征的长度刻度。对于大多数应用，0.2 Å 的高度分辨率就足够了。这个值比水分子的大小小十倍以上;使用较小的 bin 尺寸不会提供任何优势，实际上会在仪器的机械和电子噪声范围内。
4. 计算与每条力曲线的高度箱对应的平均可观察值。这种方法生成相位/振幅数据的 3D 体积，可以很容易地在任何方向上进行切片和可视化。
   注意： 原则上，来自尖端接近和缩回的力分布应该相似。人们可以根据具体样本测试使用来自其中一种或两种的数据是否更合适。特别是，生物分子和较软的较大分子可能在接近/缩回循环中表现出滞后效应。在这种情况下，建议用户如上所述修改成像条件。
5. 通过考虑尖端偏转来调整高度轮廓。此步骤是可选的，由用户自行决定。例如，对于具有较大弹簧常数 （>200 N/m） 的悬臂，稀盐溶液中的尖端偏转通常小于 <0.08 Å.，这不会对数据产生显著影响。
   注意：根据具体示例，用户可以 1） 在仔细检查其影响可以忽略不计后，忽略非常坚硬的悬臂的尖端偏转，2） 使用从整个数据集中平均的偏转曲线校正尖端高度，3） 使用来自该力曲线的相应尖端偏转数据校正每个单独力曲线的尖端高度。后一个选项在直觉上是最“正确”的，应该尽可能使用，但这种方法通常会在数据中引入更多的噪声，这些噪声超过了这种校正的好处。
6. 使用 3D 中值滤波器对数据集进行平滑处理。在大多数情况下，此可选步骤可在不影响分辨率的情况下降低噪声。保留未过滤的数据版本以及在以后的分析步骤中进行一致性检查也很有用。此外，用户可以探索更高级的过滤方法，例如基于主成分分析的方法，这些方法在大多数数据处理软件中都很容易获得。
7. 将处理后的结果以及有用的元数据（对于将 AFM 可观察对象转换为针尖采样力很重要的测量参数）保存到可用于后续分析的数据文件中。
   注意： 支持信息 中提供的三个数据处理文件可用于执行本节中列出的功能。第一个文件加载原始 3D FFM 数据并创建一个包含相关数据和元数据的 hdf5 文件;这只是将数据传输到一个更用户友好的文件中，该文件可以更容易地访问以进行处理。第二个文件根据上述步骤处理原始数据，方法是提取等效高度图像，线性化高度位移曲线，将数据值排序到相应的高度区间中，使用过滤器对数据集进行平滑处理，并将处理后的结果保存到输出数据文件中。用户还可以激活一些功能来绘制示例力曲线（原始和加工）、 xz/xy 切片和基板倾斜校正，以及执行其他后处理一致性检查。这些数据处理脚本用户友好且带有注释，显示了用户调整参数和从原始仪器文件中提取数据的确切步骤。

图 2A 显示了 3D 力映射的示意图。与在振幅调制模式下运行的其他 AFM 技术类似，振荡悬臂在表面上进行扫描。除了每个坐标处的尖端高度外，还会在尖端接近和缩回表面时收集仪器可观察物，例如相移和波幅。结果是可观察对象的 3D 数据集，特别是振荡幅度、相移和尖端偏转，可以很容易地转换为施加在尖端上的力的测量值。这种尖端调制方法适?...

选择 AFM 针尖
与任何 AFM 应用一样，探针尖端的关键特性是谐振频率、悬臂尺寸、探针半径、探针材料和弹簧常数。迄今为止，几乎所有的 3D FFM 文献都报道了使用坚硬的高频尖端。最常见的例子是硅基探针（例如 AC55TS、PPP-NCH、Tap300-G 等）探针，它们可以在其更高的谐振模式下使用¹⁴。其他研究小组选择了 USC-F5-k30-10 碳纤维尖端。下面将?...

作者声明不存在竞争性经济利益或其他利益冲突。

我们感谢 Marta Kocun 博士（庇护研究）、Takeshi Fukuma 博士（金泽）、Ricardo Garcia 博士（CSIC 马德里）、Angelika Kühnle 博士（比勒费尔德）、Ralf Bechstein 博士（比勒费尔德）、Sebastien Seibert（比勒费尔德）和 Hiroshi Onishi 博士（神户）的有益讨论。

3D FFM 实验方案的开发得到了 IDREAM（放射性环境和材料界面动力学）的一部分支持，IDREAM 是由美国能源部 （DOE）、科学办公室 （SC）、基础能源科学办公室 （BES） 资助的能源前沿研究中心。3D FFM 数据分析代码的开发得到了西北太平洋国家实验室 （PNNL） 实验室指导研发计划 （LDRD） 的支持，通过 Linus Pauling 杰出博士后奖学金计划，E.N. 非常感谢该计划的支持。在 BES 材料科学与工程部、合成和加工科学计划的支持下，PNNL 开发了 3D FFM 测量功能。PNNL 是由巴特尔纪念研究所 （Battelle Memorial Institute） 为美国能源部运营的多项目国家实验室，合同号为DEAC05-76RL0-1830。