使用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）和细胞周期标志物在质谱细胞术平台中建立细胞周期期

该协议调整细胞周期测量以用于质质细胞术平台。凭借质谱细胞术的多参数功能，直接测量碘掺入可以鉴定S期细胞，而细胞内循环标记物可以在一系列实验条件下表征每个细胞周期状态。

细胞周期阶段的调节是细胞增殖和稳态的一个重要方面。控制细胞周期的调节机制的破坏是许多疾病的特征，包括癌症。对细胞周期的研究需要能够定义细胞周期进程的每个部分中的细胞数量，以及清楚地描绘每个细胞周期阶段之间的细胞数量。质谱细胞术（MCM）的出现为通过直接测量元素同位素进行高通量单细胞分析提供了巨大的潜力，并且通过MCM测量细胞周期状态的方法的开发进一步扩展了MCM的实用性。在这里，我们描述了一种在MCM系统中直接测量5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）的方法，类似于5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）。使用这种基于 IdU 的 MCM 具有多种优势。首先，IdU在合成过程中迅速掺入DNA中，允许在短至10-15分钟的孵育中可靠地测量S期细胞。其次，IdU的测量不需要二抗或DNA降解。第三，IdU染色可以很容易地与细胞周期蛋白B1，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）和磷酸化组蛋白H3（pHH3）的测量相结合，它们共同提供了五个细胞周期阶段的清晰描述。将这些细胞周期标记物与MCM可能具有的大量参数相结合，可以与许多其他指标相结合。

质谱分析利用质谱的高分辨率和定量特性，可以检测大约40个参数。使用金属标记抗体代替荧光团偶联抗体，后者允许更多通道并产生最小的溢出1^，2。与流式细胞术相比，MCM在细胞周期分析方面各有优缺点。MCM的一个主要优点是，大量的参数能够同时测量高度异质样品中大量免疫表型不同的T细胞类型的细胞周期状态。MCM已成功用于测量人骨髓³和端粒酶缺陷4的转基因鼠模型正常造血期间的细胞周期^状态。对急性髓系白血病（AML）细胞周期状态的分析表明，细胞周期与对临床治疗的已知反应相关，提供了对功能特征的体内洞察，可以为治疗选择提供信息⁵。质谱细胞术细胞周期分析的第二个优点是能够测量可能与细胞周期状态相关的大量其他功能标志物。最近的工作已经能够通过使用IdU和针对BRU和rRNA⁶的金属标记抗体将蛋白质和RNA合成与细胞周期状态相关联。这种高度参数化的分析在连续分化过程中测量众多群体的细胞周期状态，使用目前的流式细胞术技术几乎是不可能的。MCM的主要缺点是缺乏与荧光流式细胞术中使用的DNA或RNA染色剂相当的DNA或RNA染色剂（例如DAPI，Hoechst，Pyronin Y等）。荧光染料可以相对精确地测量DNA和RNA含量，但这种精度只有在核苷酸碱基之间插层时这些染料的荧光特性发生变化时才有可能。因此，MCM分析无法以类似的精度测量DNA或RNA含量。相反，质谱细胞术细胞周期分析依赖于与细胞周期状态相关的蛋白质的测量，例如细胞周期蛋白 B1、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白 （pRb） 和磷酸化组蛋白 H3 （pHH3），并结合直接测量碘原子从 IdU 掺入 S 期细胞。这两种测量方法在正常细胞增殖期间产生高度相似的结果，但当细胞周期进程被破坏时可能会不一致。

测量每个细胞周期阶段的细胞数量对于了解正常的细胞周期发育以及细胞周期破坏非常重要，这在癌症和免疫疾病中很常见。MCM 使用金属标记抗体提供细胞外和细胞内因子的可靠测量;然而，S相的测量受到限制，因为基于铱的DNA插入器无法区分2N和4N DNA。为了定义细胞周期阶段，Behbehani开发了一种利用质量为127的IdU的方法，该方法落在质谱细胞仪的范围内，并允许直接测量S期³中的细胞。这种直接测量避免了对二抗或使用DNA变性剂（如酸或脱氧核糖核酸酶）的需求。结合细胞内循环标志物，它可以在实验模型中实现细胞周期分布的高分辨率。

该协议适用于MCM常见流式细胞术方案的细胞周期测量。我们的方法提供了一种方便和简单的方法来包含细胞周期参数。体外样品的IdU掺入仅需在37°C下孵育10至15分钟，这比大多数BrdU染色方案短，建议孵育时间为数小时^3，7。IdU和BrdU掺入的样品可以使用蛋白质组学稳定剂固定，然后在-80°C冰箱中储存一段时间。这允许将大量 IdU 染色样品存档以进行批量分析，而不会降低样品质量。

1. 制备 IdU 储备液

1. 将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）溶解在DMSO中至50mM的浓度。无菌过滤器，分装到10-50μL管中，并储存在-80°C
2. 从冰箱中取出 IdU，并在室温下解冻。在RPMI-1640中稀释IdU以制成终浓度为1mM的工作溶液。上下移液或涡旋混合。
   1. 通常，将浓缩的IdU稀释到培养细胞的培养基（例如DMEM，IMDM等）中，或将其稀释到PBS中，以直接添加到外周血或骨髓抽吸物样品中。该预稀释步骤有助于将DMSO与目标细胞的水性介质混合。
      注意:孵育期间IdU的最终浓度应为10μM;可以以每 1 mL 培养基中 10 μL 的比例添加 1 mM 的溶液。

2. IdU孵育和样品保存

1. 将样品保存在加湿的37°C培养箱中。从培养箱中取出样品并将样品移至生物安全罩中。
2. 向每 1 mL 样品中加入 10 μL 1 mM IdU。
   1. 对于 6 孔板，将 30 μL 的 1 mM IdU 添加到每个孔中的 3 mL 培养基中。IdU 也可直接用于骨髓抽吸物以及小鼠研究⁴.
3. 将样品放回37°C的培养箱中10-15分钟。在 IdU 暴露期间将细胞保持在感兴趣的最佳生长条件下，以获得最准确的 S 相测量。
4. IdU孵育后，取出样品并转移到锥形管中。
5. 在室温下以400× g 旋转样品10分钟。
6. 吸出上清液并重悬于 200 μL PBS 中。
   1. 如果需要，在此步骤中进行活/死染色（使用顺铂），以在固定和冷冻之前标记死细胞。
      注意:甲醇透化后铑活/死染色效果不佳，因此不建议将其用于细胞周期分析。
7. 向 PBS 中加入 18.75 μL 16% 多聚甲醛 （PFA），最终浓度为 1.5% PFA。在室温下孵育10分钟。在室温下以400× g 旋转样品10分钟。
8. 吸出 PBS/PFA 溶液，并在冷冻前将样品重悬于 500 μL 细胞染色培养基（CSM;1x PBS，含 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠）+ 10% DMSO 中。
   1. 如果使用商用蛋白质组学稳定剂，则向重悬于 200 μL PBS （1:1.4） 中的样品中加入 280 μL 蛋白质组学稳定剂。将样品在室温下孵育10分钟，然后直接放入-80°C中。
      注意:IdU已被证明在37°C孵育10-15分钟内有效掺入。 IdU孵育时间超过10-15分钟将逐渐降低S期和G2期群体的分辨率，因为IdU标记的细胞离开S期并进展到G2期或M期。我们还观察到，与IdU长期孵育会导致细胞死亡和细胞周期伪影。IdU掺入后的后续细胞处理和抗体染色足以洗去未掺入S期细胞的残留IdU。使用此处描述的体外方案时，我们没有观察到显着的碘背景;然而，我们很少在临床样本中观察到碘污染。这可能发生在医疗程序，例如 CT 扫描中的碘造影剂或含碘药物.如果观察到大量的IdU背景，则不应运行样品，以免损坏质谱细胞仪的检测器。

3. 用于质谱细胞术的样品染色

1. 从-80°C取出样品，并在表面染色前解冻。
   1. 如果使用SmartTube固定方法，请在0-4°C下解冻样品，以避免在样品升温时进行额外的固定。
2. 样品解冻后，将大约 1-200 万个细胞转移到 5 mL FACS 管中。
3. 将FACS管以600× g 离心5分钟，并用细胞染色培养基（CSM）填充FACS管以洗涤细胞。再重复一次。
   1. 如果已知细胞粘在一起，请在CSM洗涤液中加入400 U / mL肝素，以防止细胞与细胞接触，但这不是绝对必要的。
4. 用FC封闭剂孵育细胞，每100μL细胞5μL试剂，在室温下孵育10分钟。
5. 准备一种抗体混合物，这些抗体将染色细胞的表面或细胞外部分。在每次测试中，总染色混合物将达到每 1-2 百万个细胞 100 μL。染色混合物将在鸡尾酒和FACS管中与CSM和肝素进行相应的平衡。
   注意:在此步骤中添加CSM还将减少非特异性染色伪影⁸。这种染色混合物完全取决于感兴趣的靶标和表面表型（例如，涉及T细胞的研究将使用CD45，CD3，CD4，CD8等的表面混合物）。样品处理和染色的详细方案可以在Behbehani和McCarthy等人中找到9^，10。
6. 将表面染色混合物加入细胞中，并在室温下连续振荡孵育30-60分钟。
7. 染色后，用CSM填充FACS管，并以600× g 旋转5分钟。
8. 用CSM再洗涤两次，以600× g 旋转样品5分钟，然后吸出每次CSM洗涤。
9. 通过添加 1 mL 含有 10% CSM 和 1.5% PFA 的 PBS 来固定细胞外抗体。
10. 用CSM填充含有PBS / CSM / PFA混合物的FACS管。以600× g 旋转5分钟并吸出上清液。
11. 在-20°C下加入甲醇。
12. 涡旋样品1-2分钟以实现单细胞悬液，并验证所有细胞团块是否已重新悬浮。
13. 当样品缓慢涡旋时，使用带滤嘴的 1，000 μL 移液器快速加入 1 mL 冰冷甲醇。
14. 将 FAC 管对准灯光，并确保没有可见的团块;浑浊是意料之中的。任何团块都会导致样品无法用于后续的MCM分析。
15. 将样品在-20°C下储存10-20分钟。
16. 在此期间准备细胞内染色混合物。细胞内染色混合物将取决于感兴趣的靶标。对于细胞周期分析，在该染色混合物中包括细胞周期蛋白B1，pRb，Ki67和pHH3，但可以根据需要添加其他细胞内标志物。
17. 在-20°C下10-20分钟后，取出样品，加入1.5mL的PBS，并用CSM填充剩余部分。
18. 将样品600× g 离心5分钟，然后吸出上清液。
19. 用CSM再洗涤两次，将样品以600× g 旋转5分钟，每次吸出上清液。
20. 最后一次CSM洗涤后，离心样品并留下约50μL的残留体积。
21. 将制备好的抗体混合物（通常加入 50 μL 抗体染色混合物，以获得 100 μL 的最终染色体积）添加到样品中，并在室温下在振荡平台上孵育 30 至 60 分钟。
22. 染色后加入CSM并以600× g 离心5分钟。
23. 吸出CSM，再次用CSM洗涤，以600× g 旋转5分钟，吸出CSM，然后加入PBS。
24. 细胞内染色完成后，将细胞放入嵌入器溶液中，该溶液将抗体固定在细胞上并对每个细胞的DNA进行染色以进行鉴定。插层器溶液含有从制造商的储备溶液中以500μM的浓度添加的非同位素纯铱插层器（五甲基环戊二烯基-Ir（III）-双嘧吩嗪）。 将铱储备液在PBS和1.5%PFA的溶液中以1:4000稀释。以每百万个细胞 100-200 μL 的速度加入铱插层器溶液，以均匀染色并防止过度染色。
    注意:此插层器溶液中的铱旨在识别单线态门控的细胞，不应用于活/死染色。如果需要活/死染色，则需要在固定之前进行，如上所述和McCarthy等人^9。
25. 在CyTOF上采集样品之前，将样品储存在4°C冰箱中的插层器溶液中长达两周。

4. 质谱细胞仪操作

注意:质控细胞术操作可以因机器而异。始终建议在操作前查看CyTOF用户手册。此外，目前有两篇JoVE文章涉及机器启动和维护9^，11。

1. 在操作质谱细胞仪之前，检查雾化器是否有堵塞、裂缝和其他不规则之处。
2. 将雾化器连接到细胞仪并开始预热程序。请勿在雾化器未安装到位的情况下启动质控细胞仪。
3. 一旦质状细胞仪完成预热，就将水流过样品管线。在进行调谐或样品分析之前，雾化室需要达到大约 200 °C。
4. 流水5-10分钟。5-10 分钟后，加载调优解决方案并选择调优管理器。调谐溶液是含有固定浓度金属的溶液，用于在样品采集前优化质谱细胞仪
5. 在优化管理器中，在优化解决方案达到稳定状态命中记录后选择" 预览 "以开始自动优化过程。
6. 调谐完成后，在取样器中装满水，并在样品处理过程中让水流过取样管线。有关每日细胞仪操作和调谐的详细方案，请参见 Leipold¹¹。
7. 有时，自动调整不会调整到最佳机器性能。重复调整过程以更正此问题。
8. 在样品采集前，用CSM洗涤样品一次，用纯去离子水洗涤两次。用水洗涤对于去除PBS / CSM中的残留盐很重要。
9. 使用制造商提供的平衡微球、装载已知金属浓度的聚苯乙烯微球检查灵敏度和样品流量。
10. 将采集模式从调谐更改为事件捕获模式。将停止采集的时间限制设置为 120 秒。等待 45 秒，然后选择 "记录"。
11. 质谱细胞仪将在 120 秒后自动停止样品采集。使用雨图查看器检查 Eu151 和 Eu153 强度。
12. 在纯去离子水中以1:20的比例稀释平衡珠。
13. 在样品采集之前，请检查实验经理。使用实验管理器为通道指定名称并添加要记录的通道。
    1. 如果使用 IdU，请确保添加了 127-I 通道。
    2. 请注意，在样品采集之前，必须设置质谱细胞仪以测量所需的参数（例如IdU）。如果未提前选择频道，则不会从任何未选择的频道收集数据，也无法恢复。
14. 使用1:20纯去离子水和平衡珠混合物将细胞稀释至约1-2 x 10^{6 /} mL的浓度。使细胞通过过滤器顶部的FACS管，以去除任何残留的团块。
15. 加载样品并更改采集时间。
16. 按 预览 并等待每秒事件计数稳定下来。
    1. 不要运行每秒超过 400 个事件的事件，这将导致大量的双峰和碎片。我们通常收集至少20，000到50，000个细胞事件，但最佳数量将取决于实验设计。多达 200 万个细胞染色通常会产生 300，000 至 400，000 个细胞事件。请注意，并非所有事件都是细胞（事件计数中将包含碎片和珠子事件）。
17. 样品采集完成后，加载洗涤溶液，开始样品诱导并运行 5-10 分钟。5-10分钟后停止样品诱导并流水10-20分钟。洗涤溶液是氢氟酸的弱溶液，旨在从样品管线中剥离残留金属。
18. 关闭质谱细胞仪并取出雾化器。雾化器会很热，在处理过程中要小心。

5. 数据分析

1. 为了去除磁珠并校正样品采集过程中的信号漂移，请使用Fluidigm软件或Finck¹²开发的应用程序对FCS文件进行标准化。
2. 将FCS上传到细胞库或其他流式细胞术分析软件。FCS文件可用于任何兼容软件，出于本协议的目的，所有门控和进一步分析已在Cytobank¹³中完成。
3. 在绘制细胞周期门之前，从下游分析中排除任何双峰或细胞碎片，这可以通过使用事件长度与 191-Ir 的双轴图来完成（图 1a）。细胞将形成一个独特的，明亮的群体Ir^高 ，可用于排除双峰和碎片。这是单线门。这种门控方法通常去除约50-60%的双峰细胞事件，因此可能需要其他策略来去除剩余的双峰细胞事件。
   1. 更改事件长度刻度（最小值和最大值）以使单元格看起来更突出，以帮助单线管控。
   2. 通过使用高斯参数、残差和偏移进一步去除双峰和碎屑。具有较低偏移的较高残差也是碎片和双峰，并且围绕该种群进行门控可以进一步去除双峰和碎片（图1b，c）。
4. S相门控 – S相是最容易绘制的门，但也是最重要的。使用 IdU 与 pRb、Ki67 或 cyclinB1 的双轴图绘制此门。观察这些双轴图时，S期IdU ⁺ 细胞将形成不同的群体（图2b）。
5. G0/G1 相、G2/M 相门控 – 在 IdU 与 CyclinB1 图上建立 G0/G1 和 G2/M 相门，使用 IdU 掺入对于建立 G0/G1 和 G2/M 相门之间的边界至关重要。G0/G1 相将为 CyclinB1^低/IdU- 和 G2/M 相为 CyclinB1^高/IdU^-。良好的细胞周期蛋白B1染色将显示G0-G1和G2-M群体之间的自然群体;然而，在实验条件下，这将因样品和细胞类型而异。在细胞周期分布可能受到影响并且CyclinB1 G0 / G1相和G2 / M相之间的分离较少的实验条件下，使用S相将允许在每个特定实验中对特定细胞类型进行一致的门控。下面详细介绍了此方法。
   1. 仅在细胞周期蛋白B1与IdU上绘制S相细胞，以帮助建立G0 / G1相和G2 / M相之间的分离。在CyclinB1^高 群体上绘制一个门并进行调整，直到大约前5%的S相群体在门内（图2c）。这在 G0/G1 和 G2/M 相位栅极之间建立了断点（图 2e，f）。活动种群将更改为感兴趣的种群，居住在前一个门内的部分将是 G2/M 期种群，而其余部分将是 G0/G1 期种群。
6. G0 相位门控 – 在 pRb 与 IdU 图上建立 G0 相位。G0 相将由 pRb^低/IdU^- 群体表示。活跃的循环群体将具有高表达的pRb和IdU掺入，G0相门可以绘制在这个边界上，因为它通常在两个不同的群体中表达（图2g，i）。
   1. 通过将先前绘制的S相群体（图2b）设置为活跃群体并绘制包含前90-100%pRb^高群体的门来定义G0相。这是pRb+循环群体（图2i），该门外的pRb^低群体是G0群体（图2j）。
   2. 如果 pRb 不可用或无法记录，请使用 Ki67 与 IdU 建立 G0 期群体。绘制一个代表大多数 S 相群体的门，并使用该门作为 Ki67 与 IdU 的边界，其余的总体将是 G0 相（图 3a）。
7. M 期门控 – 在 IdU 与 pH3 双轴图中建立 M 相。M相代表非常小的一部分细胞，并在pH3^高 群体上设门（图2d）。
8. IdU掺入失败或不可能 – 如果IdU不可用，请使用Ki67和pRb定义细胞循环而不是循环级分。在正常条件下，Ki67和pRb形成两个不同的群体，Ki67高/pRb^高和Ki67低/pRb^低。双正总体代表活跃的循环总体，与 G1 期、S 期、G2 期和 M 期相关。双低人口代表非循环人口，与G0相相关（图3b）。
   注意:使用Ki67与pRb无法描述每个单独的相，但可以确定对相对循环/非循环群体的实验影响。
9. 细胞周期分析 – 建立门后，从门中导出数值以进行进一步分析。每个周期中的百分比可以通过从组合人口中减去单个总体来实现。G0相，在pRb^低IdU低电平上绘制，栅极百分比可以从G0/G1相中减去，在CyclinB1^低IdU^负上绘制，以求出G1相百分比。类似地，G2相位百分比是从G2/M相栅极中减去M相栅极得出的。这将为每个单独的细胞周期阶段生成数值;G0、G1、S、G2 和 M。为每个单独的细胞周期阶段生成的数值可用于进一步分析，例如绘图和统计分析。

利用HL-60细胞和人骨髓抽吸物，可以显示实验条件如何影响细胞周期分布和分析。首先，必须建立门控策略以证明细胞周期阶段是如何得出的。在图1中，我们显示了单线态门的建立，这对于分离细胞碎片和双峰非常重要，从而建立单细胞群。对于细胞系，单线态门是进行细胞周期分析所需的全部（图2a）。对于人类样品，通常需要在细胞周期分析之前?...

此处提供的示例演示了如何使用MCM平台分析细胞周期分布。还证明，细胞周期分析对时间和温度等实验条件很敏感，这是研究人员在考虑MCM进行细胞周期分析时必须考虑的重要考虑因素¹⁴。样品在短时间内储存，不超过一小时，其IdU掺入量将与其正常状态相当。样品在封闭系统中长时间（约2小时）将减少IdU掺入，但是，相对循环和非循环级分不会改变，允许粗细胞周期分析。低?...

Behbehani博士从Fluidigm获得旅行支持。Fluidigm还购买了用于实验室的试剂和材料。

作者要感谢Palak Sekhri，Hussam Alkhalaileh，Hsiaochi Chang和Justin Lyeberger的实验支持。这项工作得到了Pelotonia奖学金计划的支持。本材料中表达的任何意见、发现和结论都是作者的观点、发现和结论，并不一定反映 Pelotonia 奖学金计划的意见、发现和结论。