تستخدم مجموعتنا البحثية كحول بولي فينيل ، PVA ، وأغشية بولي إبسيلون كابرولاكتون ، PCL ، الأغشية النانوية الليفية لتطوير نظام الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد. يهدف إلى الإجابة على كيفية دعم الأغشية للخلايا الظهارية والخلايا الليفية التي تحاكي بيئات الأنسجة وتسهيل دراسة إشارات الزخرفة والتفاعلات الخلوية. سنوضح أن الأغشية الليفية النانوية المسامية المغزولة كهربائيا تسمح للخلايا الظهارية بتكوين أنسجة ظهارية ، مما يسمح للطبقات المتعددة والخلايا الليفية بالنمو في كل مصفوفة إضافية.
تسلط الطرق الضوء على كيف يمكن لنظام ثلاثي الأبعاد الموسع أن يوفر للأنسجة النامية بيئات أفضل مقارنة بالثقافات التقليدية إلى ثنائية الأبعاد. نحن نقدم نظام زراعة مشتركة يستخدم الخلايا الظهارية المتمايزة. يتطلب التنظيم باستخدام الخلايا الجذعية إجراء تمايز معقد ، لكن نموذجنا له مزايا في البساطة وتوفير الوقت في تطوير نظام الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد.
نحن نركز على التغلب على قيود السقالات الليفية النانوية من خلال الجمع بين الأغشية الليفية النانوية والمواد الهلامية المائية ذات الطبقة الزائدة في المزارع المشتركة. للبدء ، أضف 0.02 جرام من حمض البولي أكريليك وجرام واحد من PVA إلى زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على شريط مغناطيسي. أضف 7.8 مل من الماء المقطر إلى الزجاجة ، ثم ضع الزجاجة على طبق محرك.
بمجرد أن تبرد الزجاجة إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 0.2 مل من الجلوتارالديهايد إليها وضعها مرة أخرى على الطبق عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر للغزل الكهربائي. افصل الغطاسات عن البراميل ونظف الحطام البلاستيكي الصغير داخل البراميل وأطراف الغطاسات.
بعد ذلك ، استخدم الإبر لمنع تدفق السائل وصب محلول PVA في كل برميل حقنة. قم بتجميع الغطاسات في البراميل وإزالة الإبر. بعد تجميع إبرة معدنية جديدة عيار 27 ، ضعها في آلة الغزل الكهربائي.
لف المجمع بإحكام بورق الألمنيوم. بمجرد عودة لوحة الحاقن إلى موضعها الأصلي ، اضبط آلة الغزل الكهربائي على حجم حقن يبلغ ملليلترين ، ومعدل حقن ستة ميكرولتر في الدقيقة ، وسرعة الأسطوانة 100 دورة في الدقيقة ، ومسافة طرف إلى المجمع 14 سم. تحقق من تدفق السائل لكل مضخة ، ثم قم بتشغيل آلة الغزل الكهربائي بجهد كهربائي يبلغ حوالي 12 كيلو فولت.
بعد اكتمال عملية الغزل الكهربائي ، افصل الرقاقة التي تحتوي على حصيرة الألياف عن المجمع. قم بتخزين حصيرة الألياف النانوية في مجفف تحت الفراغ. أضف 1.5 جرام من PCL و 8.5 مل من الكلوروفورم إلى زجاجة زجاجية نظيفة.
ضع الزجاجة على طبق وقم بإذابة PCL في الكلوروفورم لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بقص قطعة صغيرة من غشاء الألياف النانوية ، وقم بتغطية القطع بطبقة ذهبية رقيقة باستخدام عملية الرش التلقائي لمدة خمس دقائق. للبدء ، قم بقص حصيرة الألياف النانوية PVA المصنعة إلى قطع بالحجم المطلوب لإدراج الترسيب.
تحضير طبق صغير يحتوي على 1.5 مل من حمض الهيدروكلوريك النقي. ضع الطبق مع حمض الهيدروكلوريك وقطع الألياف النانوية داخل غرفة مفرغة وأغلق الغطاء. ثم افتح الصمام المتصل بمضخة التفريغ وانتظر لمدة 10 ثوان حتى ترتفع أبخرة حمض الهيدروكلوريك.
أغلق الصمام وعالج الأغشية بأبخرة حمض الهيدروكلوريك لمدة دقيقتين. بعد معالجة حمض الهيدروكلوريك ، أضف قطرات من الماء المقطر إلى الأغشية. ضع الأغشية على شريحة زجاجية وقم بإزالتها من الرقاقة.
استخدم آلة طلاء الرش التلقائية لطلاء الأغشية على شريط كربوني بطبقة رقيقة من الذهب. ثم اغسل أغشية PVA النانوية المرتبطة بحمض الهيدروكلوريك ثلاث مرات باستخدام PBS وانقعها في وسط الاستزراع. بعد النقع ، تحقق من الرقم الهيدروجيني للتأكد من عدم وجود حمض الهيدروكلوريك المتبقي.
للبدء ، قم بتقطيع حصائر الألياف النانوية إلى قطع مستديرة بقطر 10 ملليمترات لأغشية النانو PVA و 13 ملم لأغشية النانو PCL. امزج قاعدة SYLGARD 184 وعامل المعالجة بنسبة كتلة 10 إلى واحدة في كوب بلاستيكي. استخدم شريحة زجاجية نظيفة لخلط محلول بولي ديميثيل سيلوكسان بقوة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تتشكل الفقاعات.
انشر نظام إدارة الرسومات الشخصي (PDMS) بالتساوي على شريحة زجاجية. اغمس الحافة السفلية للملحق جيدا قليلا في PDMS. ثم ضع الملحق رأسا على عقب على جهاز تسخين الشرائح لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى يتماسك PDMS.
افحص نظام إدارة المباني الرقمي باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر للتأكد من أنها لم تعد لزجة. الآن ، اضغط برفق على الملحق جيدا على قطعة غشاء النانو PVA ، بحيث يواجه الجزء السفلي من الإدخال جانب الألياف النانوية من الغشاء. أضف قطرة من الماء المقطر إلى وسط البئر واستخدم الملقط لإزالة ورق القصدير بعناية.
ثم ضع الملحق جيدا في لوح جديد مكون من 24 بئر واترك الغشاء يجف. عند توصيل قطعة غشاء النانو ، اغمس طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر في خليط PDMS وقم بتنقيطها بدقة في الزوايا الأربع ووسط البئر. ضع اللوحة على جهاز تسخين الشريحة واترك PDMS يتماسك لمدة خمس إلى سبع دقائق.
بعد ذلك ، ضع قطعة غشاء النانو PCL في PDMS التي تحتوي على بئر مع جانب الألياف النانوية المتصل ب PDMS. استخدم فرشاة صغيرة نظيفة للضغط على جانب رقائق الغشاء قليلا للتثبيت الكامل. ثم أضف 0.2 مل من 70٪ من الإيثانول إلى البئر لتسهيل إزالة الرقائق.
قم بتعقيم الملحق والقاع جيدا في إعداد الواجهة تحت الأشعة فوق البنفسجية طوال الليل. في اليوم التالي ، اغسل الملحق والقاع جيدا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBS إلى الملحق و 500 ميكرولتر إلى البئر السفلي لمدة ثلاث دورات مدة كل منها 10 دقائق. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، اغسلها ب 10 ملليلتر من PBS وأضف ملليلترين من 0.05٪ تريبسين EDTA لتربسينها.
اضغط على الطبق برفق لإخراج الخلايا من الأسفل. أضف ثمانية ملليلتر من وسائط الثقافة الكاملة لتحييد إنزيم التربسين ، ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. الطرد المركزي الأنبوب عند 400 جرام لمدة خمس دقائق.
بعد التخلص من فوق الطبيعة ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من DMEM الكامل باستخدام وسائط F12. ثم املأ الجزء السفلي جيدا ب 500 ميكرولتر من وسائط DMEM F12 الكاملة. انقل الغشاء الليفي النانوي PVA المرفق إلى البئر وأضف 50 ميكرولترا من تعليق خلية MLE-12.
بعد ذلك ، املأ الغشاء الليفي النانوي PCL المرفق جيدا ب 500 ميكرولتر من تعليق خلية NIH3T3. بعد احتضان الخلايا لمدة ساعتين ، قم بتجميع خلية MLE-12 التي تحتوي على إدراج وخلية NIH3T3 التي تحتوي على بئر قاع في إعداد transwell ، وكان التوزيع المكاني لخلايا NIH3T3 وخلايا MLE-12 في نظام الزراعة المشتركة يمكن تمييزه بوضوح ، مع انتشار خلايا NIH3T3 الخضراء على أعماق متفاوتة وخلايا MLE-12 الحمراء التي تشكل طبقات. تتسلل خلايا NIH3T3 إلى الغشاء الليفي النانوي PCL وتمتد على طول محاور الألياف النانوية ، بينما تلتصق خلايا MLE-12 بسطح الغشاء الليفي النانوي PDA وتظهر تجميعا.
