الفحص في المختبر القائم على LED لتقييم الجزيئات القابلة للتنشيط الضوئي في التعطيل الضوئي البكتيري

يركز بحثي على استكشاف جزيئات مختلفة من عائلة مركبات الفلافيليوم الطبيعية والاصطناعية على حد سواء مع اهتمام أساسي بدراسة نشاطها الحيوي في سياق الحماية من الضوء للأشعة فوق البنفسجية وتقييم إمكاناتها كمحسسات للضوء لتطبيقات العلاج الضوئي. أظهرت النتائج الحديثة في مجموعتنا البحثية الخصائص المنشطة للضوء لأصباغ الفلافيليوم القائمة على الأمين، مما أثبتها كفئة جديدة واعدة من المحسسات للضوء. تظهر هذه المركبات إمكانات كبيرة لمزيد من الاستكشاف ، مما يمهد الطريق لتطبيقات مبتكرة في هذا المجال.

باستخدام نظام الصفيحة الدقيقة واللوحة الضوئية ذات 96 بئرا ، يمكننا الحصول على فحص عالي الإنتاجية للحساسات الضوئية في بيئة خاضعة للرقابة ، مما يبسط تحديد المرشحين المختلفين للعلاج الضوئي والمقارنة بينهما. للبدء ، أدخل بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية على صفيحة أجار مولر هينتون من ثقافة التوقف. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على ثقافة جديدة.

اجمع مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات جديدة من صفيحة الأجار وقم بتخفيفها في ستة ملليلتر من PBS المعقم المفلتر مسبقا عند درجة الحموضة 7.4. دوامة اللقاح عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى أربع دورات لتجانس العينة وسحب ثلاثة ملليلتر من اللقاح المتجانس إلى كوفيت يمكن التخلص منه. بعد قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر ، قم بتخفيف العينة لتتناسب مع الكثافة البصرية البالغة 0.1 باستخدام PBS.

قم بإعداد محلول مخزون لمركب المحسس الضوئي في مذيب مناسب مثل DMSO أو PBS. قم بتخفيف محلول المخزون في PBS لإنشاء حل العمل ، مما يضمن عدم تداخل مكونات وسائط الثقافة البكتيرية مع امتصاص الضوء. دوامة الحل العملي لضمان التجانس الكامل.

للبدء ، قم بإعداد تعليق المكورات العنقودية الذهبية وحل العمل المركب للحساسات الضوئية. قم بإعداد لوحين منفصلين بسعة 96 بئرا ، أحدهما مخصص للتعرض للضوء والآخر للتحكم في الظلام. في كل لوحة ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر لكل من محلول التحسس الضوئي والتعليق البكتيري.

امزج المحاليل من 5 إلى 10 مرات باستخدام الماصة. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للمحسس للضوء بالتفاعل مع الخلايا البكتيرية. بعد الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة.

حافظ على حماية إحدى اللوحات من التعرض للضوء كتحكم في الظلام. ضع اللوحة الأخرى المكونة من 96 بئرا فوق لوحة LED المستطيلة 50 واط. ضع علامة على حواف اللوحة على سطح LED لضمان وضع ثابت عبر تكرار البروتوكول.

قم بتعريض اللوحة لضوء LED لمدة 15 دقيقة تقريبا. استخدم لوحا آخر من 96 بئرا لإعداد التخفيفات التسلسلية للعينات ، بما في ذلك الآبار الضابطة وغير المشعة والمشععة. أضف 180 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر ، وفقا لعدد العينات.

Aliquot 20 ميكرولترا من كل بئر في الألواح المشعة وغير المشعة في العمود الأول من اللوحة المملوءة ب PBS. باستخدام ماصة صغيرة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بسيط من البئر 1 إلى 6. قسم لوحة أجار إلى ستة أقسام متساوية مع كل قسم يتوافق مع أحد التخفيفات.

Aliquot 10 ميكرولتر من كل بئر على القسم المقابل من لوحة أجار. احتضن الطبق لمدة 18 إلى 20 ساعة. قم بإزالة لوحة أجار من الحاضنة وتحديد المناطق المناسبة لعد المستعمرات.

داخل كل قسم من لوحة المثقاب ، احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة. أظهر طيف نطاق الضوء المرئي ثلاث قمم مميزة بين 400 و 700 نانومتر. في ظل الظروف المظلمة ، لم تظهر أي من مركبات الفلافيليوم المختبرة تأثيرات سامة للخلايا.

في المقابل ، بعد التعرض للضوء ، تسببت المركبات المختبرة في انخفاض يعتمد على الجرعة في صلاحية المكورات العنقودية الذهبية مع تأثيرات كبيرة لوحظت عند تركيزات 6 و 12 ميكرومولار.