يتمثل نطاقنا في عزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا الجذعية الجذعية السرطانية البشرية وتحليل خصائصها الأساسية وفقا لعوامل النسخ أحادية الخلية. نحن نحاول الإجابة على الشخصيات والوظائف المميزة لمجموعات سكانية فرعية مختلفة من UC-MSC. أحدث التطورات في مجالنا هي اكتشاف عدم تجانس مجموعات MSC المختلطة ، في الغالب باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
حددنا المجموعات الفرعية الثلاثة داخل الخلايا الجذعية الجذعية السرطانية البشرية ، بما في ذلك الخلايا العالية من MAMBI MFGE8. تظهر هذه المجموعة الفرعية نمطا ظاهريا مميزا ، وملفا نميا فريدا من نوعه ، وإمكانات شحمية محدودة ، ونشاطا مثبطا للمناعة منخفضا في التهاب الكلية الذئبي. تعزز هذه النتائج فهم UC-MSCs وتدعم اختيار المجموعات الفرعية المثلى لعلاج أمراض معينة.
نحن نمهد الطريق لفهم الوظائف الحقيقية ليس فقط ل BAMBI عالية MFGE8 UC-MSCs ولكن أيضا للمجموعتين الفرعيتين الأخريين ، وخاصة أدوارهما في علاج الأمراض المختلفة. سنواصل التركيز على بدء تطبيقات المجموعات الفرعية البشرية UC-MSC على الأمراض المناعية المتعددة واستكشاف آلياتها الجزيئية في علاج تلك الأمراض. لعزل BAMBI عالية MFGE8 UC-MSCs عالية ، قم بزراعة UC-MSC بكثافة تقارب 5 إلى 10 أضعاف 10 إلى قوة 6 خلايا في DMEM كامل.
أضف 0.5 ملليمولار EDTA لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا. ثم أضف DMEM الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعداد تعليق خلية واحدة.
خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا التي تم حصادها. بعد العد ، قم بالطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق.
أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل لتحقيق تركيز من 5 إلى 10 أضعاف 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر ، ووضع الأنبوب على الجليد. بعد ذلك ، قسم الخلايا المحصودة إلى أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. أضف الأجسام المضادة الأولية عند تخفيف 1 إلى 100 إلى أنابيب MFGE8 و BAMBI.
امزج المحتويات جيدا واحتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف PBS لغسل الخلايا المسماة. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل.
أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المترافقة عند تخفيف من 1 إلى 1,000 إلى الخلايا المعلقة. تخلط جيدا وتحتضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في الظلام أربع 15 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف PBS وجهاز الطرد المركزي لغسل الخلايا المسماة.
أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الوسط الكامل وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الكتل والحطام. انقل المرشح إلى أنبوب سعة 15 مليلتر لفرز قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل أنبوب الخلية الفارغة كعنصر تحكم سلبي دون إضافة جسم مضاد.
اضبط إعدادات التشتت الأمامي والتبعثر الجانبي على مقياس التدفق الخلوي لإنشاء مقياس البوابات للسكان غير الملوثين. بعد ذلك ، قم بتشغيل MFGE8 و BAMBI أحادي الجسم المضاد كعنصر تحكم في البوابة لتحديد المكان الذي تبدأ فيه الإيجابية في المؤامرة. قم بتشغيل أنابيب العينة التجريبية لفرز مجموعة الخلايا العالية BAMBI MFEG8 وجمع الخلايا التي تم فرزها.
ضع الخلايا الجذعية الجذعية المرتبة في صفيحة من 24 بئرا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد نمو الخلايا التي تم فرزها من خلال ممرين ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتأكيد نقاء السكان الذين تم فرزهم. كانت UC-MSCs المستنبتة إيجابية بقوة لتعبير CD44 و CD73 و CD90 و CD105 ، وسلبية لتعبير CD14 و CD34 و CD45 و CD79 و HLA DR.
تم فرز الخلايا الجذعية العليا في BAMBI من الخلايا الجذعية العليا من الخلايا الجذعية الجذعية للبشرية المزروعة ، وتم تأكيد استمرار مستويات تعبير BAMBI و MFEG8 المرتفعة من خلال ثلاثة إلى أربعة مقاطع. تباين تواتر BAMBI العالي MFEG8 الخلايا الجذعية الجذعية بناء على طريقة المتبرع والتفكك.
