نقدم بروتوكولا مباشرا لتصور الجليكوكونجوجات السياليلية داخل الخلايا بدقة مكانية عالية ، مما يلغي الحاجة إلى معدات متخصصة. تسهل هذه الطريقة دراسة التخليق الحيوي والاتجار وإعادة التدوير في السياقات المرضية المختلفة. لتحقيق ذلك ، نجمع بين وضع العلامات الأيضية ، وكيمياء النقر ، والفحص المجهري للتمدد.
تسمح تقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة مثل STED و STORM للعلماء بتجاوز حاجز الحيود ، لكنها تتطلب معدات باهظة الثمن. في الآونة الأخيرة ، ظهر المجهر التوسعي كبديل يسهل الوصول إليه لتحسين الدقة عن طريق تكبير العينة فعليا. يمكن استخدام هذه الطريقة مع أي مجاهر روتينية كاملة الموارد.
لا يتطلب مجاهر فائقة الدقة ، وهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ويصعب الوصول إليها وتتطلب تحسينا واسع النطاق. لذلك ، يمكن نقل هذه الطريقة بسهولة إلى معظم المختبرات. للبدء ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط المكمل ب 500 ميكرومولار N-azidoacetylmannosamine إلى الخلايا المحضرة ، واحتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
ثم اغسل العينات بملليلتر واحد من PBS. باستخدام 500 ميكرولتر من 5٪ بارافورمالدهايد ، قم بتثبيت الخلايا في كل زلة غطاء واتركها ترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد غرفة رطبة مخصصة باستخدام صندوق غير شفاف بغطاء.
ضع قطعة مبللة من ورق النشاف في الأسفل ، ثم ضع طبقة من البارافيلم في الأعلى. ضع زلات الغطاء على البارافيلم بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى. لنفاذية الخلية ، أضف 200 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS. قم بإعداد مخزن مؤقت لتفاعل CuAAC لتسمية الجليكانات السياليلية المعدلة بالأزيد المصممة باستخدام المكونات المحددة. لبدء التفاعل ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت CuAAC إلى كل زلة غطاء وقم بتغطية العينة جيدا.
بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS لإيقاف التفاعل وإزالة المسبار والكواشف الزائدة. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمنع BSA. أضف 70 ميكرولترا من المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد الأساسي إلى زلات الغطاء واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي الفلوري إلى كل زلة غطاء واحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بعد غسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS ، انقل زلات الغطاء إلى صفيحة من ستة آبار وقم بتخزين العينات في ملليلترين من PBS عند أربع درجات مئوية لبضعة أيام محمية من الضوء. للبدء ، احتضان خلايا البقع المناعية باستخدام n-Acryloylsuccinimide بتركيز 3.2 ملليغرام لكل مليلتر في PBS على شاكر ميكانيكي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم اغسل العينات ثلاث مرات بمليلتر واحد من PBS. الآن ، ضع قطرة 70 ميكرولتر من محلول المونومر على قطعة من البارافيلم أضف 1.4 ميكرولتر من 10٪ N ، N ، N'Tetramethylethylenediamine و 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، ثم اخلطهما في القطرة.
ضع زلة الغطاء بسرعة على المحلول بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. اترك المحلول يتبلمر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الهضم إلى الهيدروجيل واترك عملية الهضم تستمر لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية على شاكر ميكانيكي.
بعد إزالة عازلة الهضم ، اغسل الجل ثلاث مرات بملليلترين من الماء منزوع الأيونات. الآن ، اترك الهيدروجيل يتمدد في ثلاثة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لمدة ساعتين ، مع تغيير الماء كل 30 دقيقة. للبدء ، قم بتشغيل المجهر وتأكد من تسخين مصادر الضوء.
ثم افتح برنامج اكتساب التصوير الحيوي. لإنشاء القنوات ، حدد الأطوال الموجية لإثارة الليزر المقابلة للفلوروفورات وقم بتنشيط الليزر وفقا لذلك. حدد عدسة موضوعية مناسبة مثل هدف الغمر بالزيت 63x بفتحة عددية 1.4 أو ما يعادلها.
الآن ، ضع وقم بتأمين زلة غطاء قطرها 32 ملم في حامل يتكيف مع المجهر. ضع عينة خلية البقع المناعية بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل على زلة الغطاء مقاس 32 ملم وأضف قطرة من الماء منزوع الأيونات لمنع العينة من الجفاف. بعد ذلك ، ضع الحامل مع زلة الغطاء على مرحلة المجهر فوق الهدف.
للتصوير بعد التمدد ، ضع الهيدروجيل على زلة الغطاء وقم بإجراء مسح البلاط. استخدم وضع Brightfield أو وضع مضان منخفض الكثافة بالليزر لتحديد منطقة الاهتمام وتركيزها. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصور مثل سرعة المسح ، ومتوسط الرقم ، والاتجاه ، ووضع المسح ، والطريقة ، وحجم الثقب لتحقيق الملاحظة المطلوبة.
الآن ، تصور الخلايا في البرنامج باستخدام وضع التألق المباشر. قم بزيادة طاقة الليزر تدريجيا وضبط كسب الكاشف وإزاحة لتضخيم الإشارة دون إحداث ضوضاء مفرطة ، مما يضمن تصورا واضحا للمضان دون الإفراط في التعرض. أخيرا ، قم بإجراء الحصول على الصور وحفظ البيانات بالتنسيق المطلوب ، مع ضمان تضمين البيانات الوصفية المناسبة للرجوع إليها في المستقبل.
بمجرد اكتمال الاستحواذ ، أضف كمية صغيرة من الماء منزوع الأيونات لتسهيل النقل باستخدام الملقط ونقل العينة مرة أخرى إلى لوحة الآبار الستة. ارتفع متوسط قطر نواة فيريت من 17.7 ميكرومتر قبل التمدد إلى 70.3 ميكرومتر بعد التمدد ، مما يشير إلى عامل تمدد أربعة. أظهر نمط تمييز الخلايا الليفية قبل الفحص المجهري التمدد مضالة بارزة باللونين الأحمر والأخضر تشير إلى تفاصيل تحت الخلوية في جهاز جولجي ، ولكن بدقة محدودة ، مما يمنع التحليل أثناء الوفاة.
بعد الفحص المجهري التوسعي ، لوحظ دقة مكانية محسنة بشكل كبير للهياكل تحت الخلوية مع حويصلات خضراء وحمراء أكثر تعقيدا مرئية داخل خلايا الخلايا الليفية.
