تتمثل المهمة العلمية الشاملة لمجموعتنا في تطوير علاجات علاجية لإصابات العضلات والعظام الرضحية باستخدام استراتيجيات الهندسة الحيوية. على وجه التحديد ، نقوم بتصميم مواد ذات ميزات فيزيائية حيوية قابلة للضبط لتعديل البيئات خارج الخلية ودفع الأنماط الظاهرية الخلوية المتجددة. هدفنا هو استخدام هذه المواد لتحسين الشفاء في النهاية وتعزيز نوعية الحياة.
من خلال تطبيق القص على الكولاجين أثناء تكوين الليف ، يمكن التحكم في تنظيم أو تباين ألياف الكولاجين الفردية لتوليد سقالات ذات ألياف عالية المحاذاة أو ذات نمط عشوائي مع ميزات نانوية. يمكن أن توجه هذه الميزات التفاعلات الخلوية وتنظيم الهيكل الخلوي على طول اتجاه الألياف. يمكن لهذا البروتوكول تصنيع مواد حيوية بزخرفة ليفية نانوية بدون معدات أو كواشف متخصصة باهظة الثمن.
هذا يجعلها أكثر سهولة من تقنيات التصنيع الليفية الأخرى وفعالة للغاية لتطبيقات هندسة الأنسجة التقلية اللازمة. مهدت نتائجنا الطريق لتكييف هذا البروتوكول مع بروتينات المصفوفة خارج الخلية الأخرى. نحن نستكشف رابطا حيويا مصنوعا من العضلات منزوعة الخلايا لنرى كيف يمكن لتقليد كل من زخرفة الأنسجة وتكوين البروتين أن يعزز التجدد.
يمهد هذا العمل أيضا الطريق لاستخدام المواد الحيوية الخاصة بنا في مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة. نحن نستخدم حاليا هذه التقنية لتوليد أنسجة هندسية يمكن أن تسهل الشفاء المعقد لأنواع متعددة من الأنسجة. وبالتوازي مع ذلك ، نحن نبحث في كيفية تآزر موادنا الهندسية مع المحفزات الميكانيكية.
نأمل في تحقيق فهم أعمق لكيفية توجيه الميزات النانوية للأنماط الظاهرية الخلوية وتطوير علاجات هندسية أكثر قوة في المستقبل. للبدء ، قم بقص أنبوب غسيل الكلى إلى ما يقرب من ثلاث بوصات وأعد ترطيبه في ماء فائق النقاء. ثم قم بقص أحد طرفي الأنبوب بمشبك أنبوب غسيل الكلى باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 18 ، وانقل خمسة إلى ستة ملليلتر من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول إلى الأنبوب.
بعد ذلك ، قم بقص الطرف الآخر من الأنبوب لإغلاقه. بعد ذلك ، ضع طبقة بسمك 0.5 إلى سنتيمتر واحد من البولي إيثيلين جلايكول أو رقائق الوتد في قاع طبق زجاجي. ثم ضع أنبوب غسيل الكلى المملوء بالكولاجين على طبقة الوتد.
أضف المزيد من رقائق الوتد لتغطية الأنبوب بالكامل وضع الطبق في ثلاجة أربع درجات مئوية. كل 10 إلى 15 دقيقة ، قم بإزالة رقائق الوتد المبللة من سطح أنبوب غسيل الكلى. استرجع الأنبوب بطبقة جديدة من الوتد الجاف وأعد الطبق إلى الثلاجة أربع درجات مئوية.
بعد 30 إلى 35 دقيقة ، قم بإزالة رقائق الوتد المبللة من سطح أنبوب غسيل الكلى. اشطف رقائق الوتد المبللة باستخدام ماء الصنبور واتركها حتى تجف بمنديل ورقي. ثم قم بفك أحد طرفي الأنبوب وانقل الكولاجين المخلل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة.
قم بتدوير أي فقاعات هواء في الكولاجين لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير عند 2,000 جم لمدة تصل إلى 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الكولاجين على أربع درجات مئوية لاستخدامه لاحقا. قبل يوم واحد من الاستخدام، ارسم ما يقرب من ملليلتر واحد من الكولاجين المخلل في حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة قياس 16.
ثم قم بإزالة الإبرة ولف رأس المحقنة بالبارافيلم. قم بتخزين المحقنة في وضع مستقيم عند أربع درجات مئوية طوال الليل للسماح بإزالة فقاعات الهواء الصغيرة. للبدء ، قم بإزالة حقنة من الكولاجين المحضر الممحلول من الثلاجة وقم بإرفاق إبرة غير حادة قياس 22.
ضع شريحة زجاجية في غطاء صفيحة من أربعة آبار وقم بتغطية الشريحة بما يكفي من الحرارة الدافئة 37 درجة مئوية PBS لغمرها. أمسك المحقنة بزاوية 30 إلى 45 درجة تقريبا ، وقم ببثق شرائح رقيقة من الكولاجين يدويا على الشريحة الزجاجية. انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يكتمل الكولاجين في تكوين الليف أو حتى يتحول إلى اللون الأبيض المعتم.
ثم استخدم الملقط لتقطيع شرائح الكولاجين إلى الطول المطلوب. واحدة تلو الأخرى ، قم بلف شرائح الكولاجين برفق بالطول بالتوازي مع المنطقة المسجلة فوق شريحة زجاجية جاهزة. دس حواف الشرائط تحت الشريحة.
استمر في وضع شرائح الكولاجين حتى يتم تحقيق الأبعاد المرغوبة. الآن ، ضع هيدروجيل الكولاجين المشكل حديثا عبر بئرين من لوحة البئر. اترك الهلاميات المائية على سطح الطاولة حتى تجف لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات أو حتى تغطي بلورات ملح PBS 50٪ إلى 90٪ من سطح الهيدروجيل.
ثم اغمر كل هيدروجيل في PBS لمدة 30 إلى 60 ثانية أو حتى تذوب بلورات الملح. تخلص برفق من PBS الزائد من الهلاميات المائية بمنديل. أخيرا ، ضع الهلاميات المائية مرة أخرى على لوحة البئر واتركها لتجف في غطاء الدخان طوال الليل.
للبدء ، قم بإزالة حقنة من الكولاجين من الثلاجة وقم بإرفاق إبرة غير حادة قياس 22. قم بثق الكولاجين بمعدل 3.2 مل في الدقيقة تقريبا على شريحة زجاجية جافة. تأكد من بثق ما يكفي من الكولاجين للحصول على أبعاد مثل مرطبات الكولاجين المحاذاة.
الآن ، استخدم الملقط لغمر الكولاجين المبثوق في أنبوب سعة 50 مليلتر من 10XPBS الدافئ. انتظر من 45 إلى 60 ثانية حتى يكتمل الكولاجين في تكوين الليف أو حتى يتحول إلى اللون الأبيض المعتم. ثم امسح برفق PBS الزائد من الكولاجين بمنديل.
بعد شطف وتجفيف الهلاميات المائية ، قم بتعقيمها ولوحة البئر المحيطة بها في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. ارفع الهلاميات المائية لفترة وجيزة في منتصف عملية التعقيم باستخدام ملقط للتأكد من أن كلا من الجانب السفلي من الشريحة الزجاجية والهيدروجيل على اتصال بالإيثانول. ثم قم بإزالة الإيثانول واترك الهلاميات المائية تجف في الهواء لمدة 10 دقائق.
اغسل الهلاميات المائية ثلاث مرات في PBS معقم لمدة 10 دقائق لكل منها لإزالة الإيثانول المتبقي وإعادة ترطيب الهلاميات المائية. أظهرت صور المجال الساطع للأرومات العضلية الهيكلية الأولية للفأر أن التوجيه الطوبوغرافي النانوي متباين الخواص لألياف الكولاجين يعزز المحاذاة الخلوية.
