نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق

يقدم بروتوكولنا نظام كشف سريع وحساس للغاية لفيروس الضفدع 3. ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تمكن من الكشف عن فيروسات الحمض النووي في نقاط الرعاية ، وتلعب دورا حاسما في منع حدوث الأمراض الوبائية. تكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في دمجها لتقنية RPA مع نظام CRISPR / Cas12a ، الذي يكمله مجهر محمول قائم على الهاتف الذكي وتصنيف الذكاء الاصطناعي.

يعزز هذا التكامل بشكل كبير كفاءة الكشف ودقته مع تقليل الأخطاء المنسوبة إلى العوامل البشرية في نفس الوقت. للبدء ، أضف إنزيمات RPA الرئيسية الأربعة في المخزن المؤقت للتفاعل. ثم أضف الاشعال المصممة مسبقا إلى الخليط.

دوامة الخليط جيدا. أضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي المستهدف الذي تم الحصول عليه من فيروس الضفدع 3 إلى كل تفاعل RPA ، ودوامة للخلط جيدا. بعد ذلك، ماصة سبعة ميكرولترات من 100 مليمول كلوريد المغنيسيوم لبدء التفاعل.

احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإكمال الفحص. تحضير بروتين بكتيريا Lachnospiraceae CAS12a مع CRISPR RNA لتشكيل مجمعات وظيفية. امزج البروتين البكتيري و 10 × كريسبر / كاس 12 أ عازلة للتفاعل.

أضف الآن 500 مسبار مراسل نانوي أحادي الشريط من الحمض النووي. أضف ميكرولترا واحدا من منتج تفاعل RPA إلى خليط تفاعل CRISPR / Cas12a CRISPR RNA. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بقياس إشارات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. للكشف باستخدام مجهر الهاتف الذكي ، أولا ، ماصة خليط التفاعل المحضر على شريحة زجاجية منسحبة. ثم قم بتغطيته بغطاء قبل الحضانة.

ضع الشريحة على مسرح مجهر الهاتف الذكي ، واضبط البعد البؤري والوضوح. التقط صورة لقياس إشارات الفلورسنت. استخدم ImageJ لقياس متوسط القيمة الرمادية لكل صورة والانحراف المعياري لمتوسط القيمة الرمادية في مجموعة تركيز.

اعتماد نموذج التعلم العميق AlexNet 33 للتصنيف. الآن استخدم Python لإعادة تشكيل الصور المدخلة إلى 224 × 224 بواسطة ثلاث قنوات. أخيرا ، استخدم شبكة أساسية مدربة مسبقا مع مجموعة بيانات ImageNet لاستخراج ميزات الصورة.

قدم الزوج السادس من الاشعال أقصى كفاءة تضخيم ، وتم اختياره. أثبتت كريسبر RNA-3 أنها الأكثر كفاءة للانقسام الجانبي. أدى استخدام نظام كشف مطور مع بادئات RPA مختارة و CRISPR RNA إلى اختلافات كبيرة بين 10 aM FV3 والتحكم.

النقطة الأكثر أهمية التي يجب تذكرها هي خطوة اكتشاف CAS 12a المحددة. يمكن تعديل أو إعادة تصميم الحمض النووي الريبي كريسبر للتفاعل لاستهداف فيروسات الحمض النووي الأخرى بناء على اكتشاف CAS 12a. يمكن أن تساعد الطريقة المقترحة في التقييم الأولي لكمية الفيروس المستهدف.

بناء على ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل qPCR للحصول على حمل فيروسي أكثر دقة. توفر هذه التقنية محاولة أولية نحو الكشف المحمول عن فيروسات الحمض النووي. أما بالنسبة لفيروس الضفدع 3 المستخدم في هذا البروتوكول ، فإن الكشف في الوقت المناسب يمكن أن يؤدي إلى اتخاذ تدابير وقائية فعالة ، مما يقلل من الخسائر في صناعة التربية.