يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في العديد من الدراسات الثقافية وتوفير أداة جديدة للتحقيق في الاتصال الخلوي المباشر. يوفر هذا الجهاز الجديد وقتا كبيرا في إنشاء نموذج استزراع وينطبق على أنواع الخلايا المختلفة التي تتطلب طلاءا معينا أم لا. في الواقع ، تسمح الأجزاء الأربعة من الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد بزراعة أنواع مختلفة من الخلايا في طبقة أحادية ، أو في 3D بنفس الطريقة مع مجموعات مختلفة.
تعتبر الإدخالات المطبوعة 3D أكثر متانة ومرونة وقابلية للتطوير ويمكن استخدامها لتصميم نماذج تجريبية لدراسات الأمراض الفسيولوجية ، مثل علم المناعة أو الأندروجينيسيس. للبدء ، امزج المكونين ، السيليكون الغذائي ، والمحفز المتوفر في المجموعة بنسبة 10: 1 ، باستخدام ملعقة معقمة من الإيثانول بنسبة 70٪ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضع الحشوات على مزيج السيليكون باستخدام الملقط بحيث يتم توزيع الخليط بشكل متجانس على الحافة السفلية للإدخال.
ضع الحشوات في آبار صفيحة ستة آبار واضغط برفق للتأكد من أن الحشوات على اتصال وثيق باللوحة لتجنب أي تسرب لوسط زراعة الخلايا. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لدعم عملية تصلب السيليكون لمدة ساعة واحدة. بعد التصلب ، قم بتعقيم الألواح بالحشوات عن طريق غمرها في حمام إيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
بعد ذلك ، تخلص من الكحول عن طريق السحب ، واترك الطبق يجف طوال الليل في غطاء زراعة الخلايا. لزراعة الخلايا الكيراتينية في غمد الجذر الخارجي والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية ، تخلص من الوسط من القوارير وأضف خمسة ملليلتر من التربسين لفصل الخلايا. ضع القارورة التي تحتوي على الخلايا الكيراتينية في غمد الجذر الخارجي عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق ، واحتضن القارورة التي تحتوي على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر ، امزج محلول التربسين الذي يحتوي على الخلايا الكيراتينية لغمد الجذر الخارجي مع خمسة ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الوسيطة المكمل ب 5٪ FBS وعوامل النمو والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية مع خمسة ملليلتر من وسط الخلايا البطانية المكمل ب 5٪ FBS وعوامل النمو. أجهزة الطرد المركزي الخلايا الكيراتينية لغمد الجذر الخارجي ومعلقات الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية عند 200 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر من الوسائط الخاصة بها.
امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء ، وأضف 10 ميكرولتر من المزيج إلى غرفة شريحة العد. أدخل شريحة العد في نظام عد الخلايا واكتشف رقم الخلية وصلاحيتها. بعد تحضير تعليق الخلية بتركيز 50،000 خلية لكل مليلتر في الوسط المعني ، قم بتوزيع 800 ميكرولتر على ملليلتر واحد من تعليق الخلية في المقصورات الكبيرة الفردية ، و 100 إلى 150 ميكرولتر في المقصورات الصغيرة الفردية مع ماصة.
انظر الخلايا الكيراتينية في وسط الخلايا الجذعية الوسيطة المكملة ب 5٪ FBS وعوامل النمو والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية في وسط الخلية البطانية ، مكملة ب 5٪ FBS وعوامل النمو في المقصورات الصغيرة والكبيرة الأخرى. ضع صفيحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، أو في ظل الظروف المعتادة ، للسماح بالتصاق الخلية و / أو النضج. أفرغ وسائط الاستزراع للمقصورات المختلفة للإدخالات باستخدام ماصة.
ثم شطف الخلايا مع ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية PBS الدافئة في المقصورات الكبيرة ، و 200 ميكرولتر في المقصورات الصغيرة. أضف ثلاثة ملليلتر من وسط شائع محدد ليكون متوافقا مع جميع أنواع الخلايا. ضع اللوحة التي تحتوي على المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة.
افصل الخلايا باستخدام التربسين لحساب معلق الخلية ، وتحقق من صلاحيتها باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. بعد مراقبة التشكل ، احسب عدد خلايا المقصورات المختلفة أثناء التجربة تحت المجهر الضوئي بعد 24 إلى 48 ساعة من الحضانة. أولا ، قم بإزالة الإدخالات من لوحة الآبار الستة في نهاية التجربة عن طريق تحريف طفيف ، ثم قم بإزالة السيليكون من الإدخالات عن طريق سحبه.
اغسل الحشوات بمنظفات زراعة الخلايا التقليدية ومواد التنظيف. ثم تعقيم إدراج لاستخدامها في المستقبل في الأوتوكلاف ، أو عن طريق غمرها في حمام الإيثانول 70 ٪ لمدة ساعة واحدة. تمت مقارنة النمط الظاهري وصلاحية الخلية ، حيث لوحظت 90٪ من الصلاحية في آبار ألواح الآبار الستة ، وعند 91٪ لوحظت في الإدخالات المطبوعة 3D للخلايا الكيراتينية في غمد الجذر الخارجي.
كانت صلاحية الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية 85٪ في آبار صفيحة الآبار الستة ، بينما كانت 86٪ في الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد. أظهرت اتصالات الخلايا غير المباشرة بين الخلايا الكيراتينية والخلايا البطانية في الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد أنه في وجود الخلايا الكيراتينية في الإدخالات ، زاد تكاثر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية بشكل ملحوظ بمقدار 1.5 ضعف بعد 24 ساعة ، وبمقدار 3.1 أضعاف بعد 48 ساعة مقارنة بالسيطرة. ومع ذلك ، فقد تبين أن الخلايا الكيراتينية لوسط حالة غمد الجذر الخارجي تزيد بشكل كبير من تكاثر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية بمقدار 1.5 ضعف بعد 24 ساعة ، وبمقدار 2.1 ضعف بعد 48 ساعة.
تم اختبار نموذج الثقافة المشتركة للإدراج المطبوع 3D لتحديد تأثير الخلايا الكيراتينية على هجرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية. في حالة السيطرة ، هاجرت الخلايا البطانية وغطت حوالي 44 ٪ من منطقة الجرح بعد 24 ساعة. في وجود الخلايا الكيراتينية ، لوحظت زيادة كبيرة في هجرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية ، مما يدل على أن 43٪ 67٪ و 99٪ من منطقة الجرح تمت تغطيتها بعد ثلاث و 12 و 24 ساعة على التوالي.
وبالمثل ، تزداد هجرة HDMECs في وجود الخلايا الكيراتينية لوسط حالة غمد الجذر الخارجي. من الأهمية بمكان ضمان ختم الملحق على اللوحة ، من أجل منع تسرب وسط الخلايا من حجرة إلى أخرى. يمكن إجراء العديد من التطبيقات ، مثل الانتشار ، والهجرة ، وفحوصات تكوين المهدئات ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين وغيرها من التحليلات.
