بروتوكولنا مهم لأنه يصف جيلا من نماذج زراعة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية ، وهذا النموذج يمثل بيولوجيا الورم في العالم الحقيقي بشكل أفضل من خطوط الخلايا. هذا النهج ينطبق على مجموعة متنوعة من الأورام الصلبة. كما أنها فعالة من حيث التكلفة حيث يمكن إجراؤها من البداية إلى النهاية في مختبر بيولوجيا الخلية النموذجي.
تدعم نماذج الورم 3D التي تم إنشاؤها باستخدام هذا النهج الأبحاث حول حساسية ومقاومة الأورام للعلاجات المضادة للسرطان أو مجموعة من العلاجات. هذا النهج يولد نماذج 3D من الخلايا السرطانية الأولية. لذلك ، يمكن أن يحدد العلاج الذي من المحتمل أن يكون فعالا لمريض معين وبالتالي يساعد في تخصيص علاجه.
ستوضح العملية إيلا إسحاقي ، طالبة دكتوراه من مختبري. للبدء ، خذ دورق T25 صغير مع مزرعة خلية أولية ملتصقة بخلية واحدة وقم بإزالة وسائط زراعة الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، وأضف ملليلتر واحد من 1x Accutase لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية لإعداد تعليق خلية واحدة لمزارع الخلايا السرطانية الأولية الملتصقة من التقاء 75 إلى 100٪.
تحييد محلول Accutase بإضافة خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا. نضح الخلايا مع ماصة مصلية 10 ملليلتر ، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ، وأضف ثمانية ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة فوق حبيبات الخلية ، ثم اخلطها برفق. لحساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم ، خذ حصة من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطها مع 50 ميكرولتر من تريبان الأزرق. ثم عد الخلايا الحية ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا الحية في التعليق.
بعد ذلك ، قم بإعداد وسط ثقافة 3D. وبعد حساب عدد الخلايا اللازمة للفحص والحجم الكلي المطلوب ، قم بإعداد تعليق الخلية بالعدد المطلوب من الخلايا في 200 ميكرولتر من وسط الثقافة ثلاثي الأبعاد. امزج بلطف مع الماصة لضمان التوزيع المتجانس.
انقل التعليق إلى خزان ماصة ، وأضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا منخفضة للغاية مع ماصة متعددة القنوات. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفرض تجمع الخلايا ، وبالتالي تحسين تجميع الخلايا ، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب. بعد الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة 50٪ من الوسط برفق والتخلص منه ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط الثقافة ثلاثي الأبعاد الطازج لاستبدال المحلول الحالي.
كرر هذه الخطوة ، وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة المرطبة بثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5٪. افحص الخلايا تحت المجهر كل يوم إلى يومين لمراقبة تكوين الكرة الأرضية. قم بقياس قطر الأجسام الكروية المتكونة باستخدام أداة المقياس في برنامج التصوير.
وبمجرد أن يصل قطر الكرة إلى 100 إلى 200 ميكرومتر ، قم بإجراء تجارب فعالية الدواء. لجمع الكروية ، استخدم ماصة 1،000 ميكرولتر لجمع الأجسام الكروية من كل بئر ، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. قم بطرد الأنبوب المخروطي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بشفط المادة الطافية بعناية والتخلص منها باستخدام ماصة.
أضف 0.5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات جيدا ولكن برفق. لإجراء عد كروي ، استخدم لوحة 96 بئرا وارسم علامة زائد على الجانب السفلي من البئر لتقسيم البئر إلى أرباع. أضف 50 ميكرولترا من التعليق إلى البئر.
وباستخدام عدسة موضوعية 10x ، عد الكرويات يدويا تحت المجهر. عد الكرويات في كل ربع ، واحسب العدد الإجمالي للكرويات في البئر. ثم احسب تركيز الكرة عن طريق مضاعفة عدد الكرويات عن طريق حساب الحجم ، وحساب العدد الإجمالي للكرويات في التعليق.
في أنبوب جديد ، تحضير تعليق كروي بتركيز 200 كروي لكل 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلية. لكل علاج دوائي ، قم بإعداد مخزون الأجسام الكروية في أنبوب مختلف. احسب الكمية الإجمالية اللازمة لكل دواء بعدد الآبار اللازمة للتكرار ، وأضف الدواء إلى الأنبوب إلى التركيز النهائي المطلوب.
انقل 200 ميكرولتر من التعليق الكروي إلى آبار صفيحة 96 بئرا منخفضة للغاية ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد احتضان الأجسام الكروية بعقار الدراسة لمدة 24 إلى 72 ساعة ، قم بطرد اللوحة عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة 170 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا برفق ، تاركا 30 ميكرولترا في قاع البئر. قم بإعداد محلول MTT ، وأضف 70 ميكرولترا من المحلول إلى كل بئر إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
سيكون تركيز MTT النهائي في البئر 0.05 ملليغرام لكل 100 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد الآبار الفارغة بمحلول MTT بدون خلايا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ثلاث إلى أربع ساعات حتى يلاحظ تغير في لون المحلول في الآبار.
عند ملاحظة تغيير ، أضف 100 ميكرولتر من محلول Stop إلى كل بئر ، وامزج محتوى الآبار برفق دون إنشاء فقاعات. اقرأ امتصاص اللوحة في قارئ ELISA المعلمة بطول موجي يبلغ 570 نانومتر وطول موجة خلفية من 630 إلى 690 نانومتر. لحساب صلاحية الخلية ، احسب الإشارة المحددة لكل بئر.
ثم احسب متوسط قيمة الآبار الفارغة ، واطرح هذه القيمة من كل بئر. احسب متوسط الإشارات المحددة في آبار التحكم التي تحتوي على خلايا لم تتم معالجتها بعقار الدراسة. أخيرا ، احسب صلاحية الخلايا في كل بئر بالنسبة للآبار ذات الخلايا غير المعالجة.
يظهر هنا تكوين كرويات من مزرعة خلايا سرطان القولون الأولية بمرور الوقت من خلال عدد الخلايا المصنفة في البداية. من هذا الشكل ، يمكن ملاحظة أن عدد الأجسام الكروية المتولدة يعتمد على عدد الخلايا التي تم زرعها في البداية في كل بئر. تظهر هنا كرويات من خلايا سرطان القولون الأولية بعد 10 أيام في الثقافة مع بذر أولي للخلايا يبلغ 2000 لكل بئر.
عند الاستزراع المطول للكرويات السرطانية للقولون ، بدأوا في الالتصاق ببعضهم البعض وشكلوا مجموعات من الكرات والهياكل الشبيهة بالعنب التي منعت ثقافة متجانسة وبالتالي حظرت استخدام الكرويات في فحوصات MTT. تظهر هنا آثار palbociclib و sunitinib ومزيجهما على الأجسام الكروية من الخلايا السرطانية الأولية ، بما في ذلك سرطان القولون والثدي. تم إجراء اختبار MTT على كرويات مشتقة من خلايا سرطان القولون والثدي.
تم تطبيع إشارات MTT إلى قيم من الخلايا المعالجة DMSO. تمثل القيم الوسائل من أربعة إلى ثمانية مكررات. كما تم تقييم آثار العلاجات المختلفة على نمو الخلايا مجهريا في اليوم صفر وبعد ثلاثة أيام من علاج الكرويات المشتقة من سرطان القولون وخلايا سرطان الثدي.
يتم عرض آثار تراستوزوماب بالإضافة إلى فينوريلبين و 5 فلورويوراسيل بالإضافة إلى سيسبلاتين على كرويات مشتقة من سرطان الثدي بمرور الوقت في هذا الشكل. يظهر هنا التغير في قطر الأجسام الكروية بالنسبة لليوم صفر حسب مدة العلاج. تضمنت كل مجموعة معالجة أربعة إلى ستة آبار مع كروي واحد في كل بئر.
يتم عرض متوسط التغيير هنا. تعتبر الأجسام الكروية أدوات مهمة للعديد من الدراسات التي تتجاوز الاستجابة للعلاج المضاد للسرطان. تتناول هذه الدراسات ، على سبيل المثال ، توصيل الأدوية وحتى أسئلة البيولوجيا الأساسية مثل تفاعلات الخلايا والخلايا.
من الأهمية بمكان بدء عملية توليد كروية مع تعليق خلية واحدة. من المهم أيضا استخدام ألواح تثبيت منخفضة للغاية مع وسيط يحتوي على مقاييس غشاء أساسية بنسبة 5٪.
