اختلال الصيغة الصبغية هو السبب الوراثي الرئيسي للإجهاض المبكر لدى البشر. تحدث معظم الأخطاء في فصل الكروموسومات أثناء الانقسام الميوزي في الخلايا البيضية. لذلك ، يعد تقييم نقطة تفتيش تجميع المغزل في البويضات أمرا بالغ الأهمية لفهم سبب تعرض البويضات للخطأ.
هنا نصف ثلاث تقنيات لتقييم سلامة SAC بشكل شامل في بويضات الفئران من خلال فحص الخطوات الحرجة المختلفة عند نقطة التفتيش باستخدام مزيج من التصوير الحي والتألق المناعي. ستوضح الإجراء الدكتورة سيسيليا بلينجيني ، باحثة مشاركة من مختبري. للبدء في تحضير ملليلتر واحد من وسائط الاستزراع التي تحتوي على نوكودازول وريفيرسين مع DMSO كعنصر تحكم كما هو موضح في المخطوطة.
لنضوج البويضة والتصوير الحي ، استخدم صفيحة 96 بئرا تم تسخينها مسبقا في حاضنة. وتحميل البئر الأول والثاني والثالث ب 150 ميكرولتر من التحكم DMSO و nocodazole و nocodazole بالإضافة إلى علاج Reversine على التوالي. مع الاحتفاظ باللوحة في الحاضنة تحت الظروف الموضحة في المخطوطة.
لبدء النضج العضلي ، قم بإزالة الميلرينون عن طريق نقل البويضات بالتتابع من خلال 6 قطرات من 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الخالية من الميلرينون التي تحتوي على DMSO. ووضعها في البئر المقابلة للوحة 96 بئر. استخدام ماصة تعمل باليد أو الفم أثناء عرض البويضات تحت مجهر ستيريو.
قم بتصوير البويضات باستخدام مجهر المجال الساطع المجهز بغرفة حاضنة مع بيئة خاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 80٪ رطوبة. التقط الصور في المستوى الأوسط للبويضات على فترات 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. بعد تحديد عدد البويضات التي تقذف الجسم القطبي عن طريق تحديد الخلايا التي تمر عبر السيتوكينات غير المتماثلة مع خلية صغيرة بجوار البويضة وداخل المنطقة الشفافة المشتركة.
عرض الصور باستخدام برنامج التصوير. حقن ميكرو برو المرحلة الأولى من البويضات المحتجزة مع 100 نانوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي securin-gfp المعد مسبقا. بعد الحقن المجهري ، اسمح للبويضات باستعادة وترجمة الحمض النووي الريبي في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات على الأقل.
ثم قم بتحميل 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع أو بدون خمسة ميكرومولار من نوكودازول. و 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع 0.5 ميكرومولار من الانعكاس في ثلاثة آبار مختلفة من صفيحة 96 بئرا. اغسل البويضات المحقونة الدقيقة من خلال ست قطرات من وسائط الاستزراع الخالية من الميلرينون وانقل ثلث البويضات إلى كل علاج.
احتفظ باللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ورطوبة 80٪ حتى تستأنف البويضات الانقسام الاختزالي ، بعد حوالي ثلاث ساعات من غسل ميلرينون. تسجيل صور نضوج البويضة باستخدام مجهر مضان مجهز بغرفة حاضنة. استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد تدمير securin-gfp وفتح صور قناة GFP ، بدءا من الوقت 0.1.
في برنامج التحليل المفضل ، استخدم أداة التحديد أو الشكل لتمييز كل بويضة وإنشاء منطقة اهتمام لكل خلية. استخدم نفس منطقة الاهتمام لتحديد منطقة خلفية ليتم طرحها لاحقا وقياس كثافة بكسل GFP في كل منطقة اهتمام في جميع النقاط الزمنية. أخيرا لكل قيمة من قيمة GFP ، اطرح قياس المنطقة محل الاهتمام في الخلفية.
بعد تقسيم الانقسام الميوزي إلى ثلاث مجموعات ، انقل كل مجموعة من الانقسام الميوزي إلى 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الحر من الميلرينون. قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني وضعها في الحاضنة لمدة ثلاث وخمس وسبع ساعات للوصول إلى المرحلة الأولى من المرحلة الأولى والطور الأولي المتأخر الأول والمرحلة الأولى على التوالي. في النقاط الزمنية المحددة ، قم بإصلاح البويضات عن طريق نقلها إلى 500 ميكرولتر قطرات من 2٪ بارافورمالدهيد في المخزن المؤقت PME لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام طبق زجاجي من تسعة آبار.
ثم انقل الخلايا إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول الحظر. لمواصلة الكشف عن MAD2 ، انقل البويضات إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول النفاذية. بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، انقل الخلايا إلى بئر جديد من محلول الحجب واحتضانها لمدة 10 دقائق.
انقل البويضات إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب مع الجسم المضاد MAD2 والجسم المضاد المضاد للسنترومير واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. لغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة بعد نقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت PME المكمل بنسبة 0.5٪ Triton ، احتضان لمدة 10 دقائق في الغرفة المرطبة. نقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مثل مضاد الإنسان 633 ومضاد للأرانب 568.
واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لتركيب الخلايا على شريحة المجهر ، انقل الخلايا إلى قطرة 10 ميكرولتر من وسائط التركيب التي تحتوي على DAPI. أضف نقاطا صغيرة من الفازلين إلى كل ركن من أركان قسيمة الغطاء.
ضعها بعناية فوق قطرة الوسائط المتصاعدة واضغط ببطء للتوزيع. أغلق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف. حركية الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر مجهز بهدف 40 أو 63 X.
وباستخدام إشارة الأجسام المضادة المضادة للسنترومير ، حدد نطاق Z الذي يسمح بتصوير منطقة الكروموسوم بأكملها. قامت بويضات التحكم المعالجة DMSO ببثق جسم قطبي بعد حوالي 14 ساعة من إطلاقه من ميلرينون. بعد تنشيط SAC ، تم القبض على البويضات المعالجة بالنوكودازول في الطور الاستوائي الأول ولم تقذف جسما قطبيا.
ومع ذلك ، في غياب تنشيط SAC ، قذفت البويضات جسما قطبيا على الرغم من عدم وجود ملحقات للأنابيب الدقيقة الحركية. تم تقييم معدل تحلل securin-gfp أثناء النضج العضلي. حيث تبدأ كثافة البويضات المعالجة DMSO في الانخفاض في حوالي 10 ساعات بعد غسل ميلرينون.
عندما نضجت البويضات في وجود عامل تنشيط SAC ، كانت مستويات نوكودازول وسيكورين-gfp مستقرة خلال فترة النضج العضلي بأكملها. في المقابل ، عند منع تنشيط SAC مع العلاج العكسي ، تسارع نمط securin-gfp وبدأ التدهور في حوالي أربع ساعات بعد غسل milrinone بما يتفق مع تثبيط SAC. تم استخدام التصوير البؤري للكشف عن السنتروميرات ونضج MAD2 من البويضات إلى الطور الأولي الأول المبكر ، والطور الأولي المتأخر الأول ، والطور الاستوائي الأول.
لتقييم قوة إشارة SAC ، تم تحديد كثافة البكسل MAD2 الموضعية في الحركية. تحدث مستويات كبيرة من تجنيد MAD2 إلى حركية في المرحلة الأولى المبكرة عندما لا يتم ربط معظم الحركية بالأنابيب الدقيقة. انخفضت مستويات MAD2 في الطور الأولي اللاحق وكانت غائبة تقريبا في الطور الاستوائي الأول عندما تم ربط جميع الحركية بثبات بالأنابيب الدقيقة.
من المهم تسليط الضوء على أن كل من هذه التقنيات لها حدودها وتفسيرها. ونقترح إجراء مجموعة من هذه الطرق لتقييم سلامة SAC. تسمح هذه المقالات الثلاثة للباحثين بتقييم صرامة الكيس في البويضات مما يعطي نظرة ثاقبة حول سبب محتمل لاختلال الصيغة الصبغية في البويضات البشرية.
