يتيح البروتوكول الموضح هنا وضع العلامات وعزل سلالات خلايا معينة موجودة في بصيلات المبيض بدءا من المراحل الغارية المبكرة ، مما يتيح التحليل عالي الدقة والثقافة. يستخدم هذا النهج الدقيق للغاية مجموعات من الأجسام المضادة المترافقة الفلورية لاستهداف علامات سطح الخلية التي يتم التعبير عنها بقوة وعلى وجه التحديد بين سلالات الحبيبية المنفصلة والسدى والثيكا. ابدأ بوضع المبيض في طبق بتري معقم ، واسكب وسطا مبردا معه لترطيب الأنسجة ، مع التأكد من أن المبيض نصف مغمور في الوسط.
إزالة أي خيوط أو مواد أخرى، وتشريح الأنسجة المحيطة المتبقية بعيدا عن المبيض. لعزل البصيلات الغارية ، حدد البصيلات الفردية واختر بصيلات صحية. استبعد أي بصيلات مملوءة بالدم أو داكنة أو غير متماثلة.
عزل الجريبات الغارية المختارة من المبيض باستخدام المشارط ، والحفاظ على الغار سليما واستئصال الأنسجة القشرية التي تشمل المسام. ضع كل جريب غاري سليم تم استئصاله في بئر واحد من صفيحة الآبار الستة. باستخدام مسطرة موضوعة أسفل الطبق ، حدد قطر الجريب لأغراض وصفية.
باستخدام مشرط ، قم بتقسيم الجريب الغاري السليم لتقييم التجويف الغاري وإضافة ستة ملليلتر من وسط انفصال الخلايا الأنزيمية قبل احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف ستة ملليلتر من الوسط المتاح الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني ، أو FBS ، واغسله بالوسط عن طريق السحب القوي المتكرر فوق البصيلات المنقسمة باستخدام ماصة P-1000 الدقيقة. بعد ذلك ، اجمع الوسيط وقم بتمريره عبر مرشح 100 ملم.
بعد الطرد المركزي للطافي المصفى عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل ذلك ، قم باستنشاق المادة الطافية. ضع الأنسجة المتبقية في خليط من 100 وحدة لكل ملليلتر كولاجيناز ووحدة واحدة لكل ملليلتر ديباز مخفف في محلول ملحي متوازن قبل 30 دقيقة من الحضانة. تعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق الثقب والسحب القوي مرتين بعد 10 و 20 دقيقة.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، استرجع الأنسجة واغسلها عن طريق السحب ، من خلال طرف ماصة P-1000 ، وقم بتصفيتها من خلال مرشح 100 ملليلتر. قم بطرد الأنسجة المتوترة عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل وضع حبيبات الخلية المخصبة بخلايا الثيكا وخلايا السدى على الجليد لوضع العلامات و FACS. لتحديد الخلايا الحبيبية وخلايا الثيكا ، أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع يحتوي على أجسام مضادة مقترنة مباشرة واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد غسل الخلايا وطردها مركزيا ، أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 4-6 دياميدينو -2 فينيليندول ، أو DAPI ، وقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال أداة FACS لالتقاط عدد صغير من الخلايا ، باستخدام كثافة الفلورسنت للأجسام المضادة المترافقة الفلوروفور للبوابة. يقسم ما تبقى من المبيض. استئصال النخاع باستخدام مقص ناعم منحني ومشارط ، وتجنب تلف قشرة المبيض.
استمر في معالجة وترقق قشرة المبيض عن طريق الكشط اللطيف حتى يبقى الحد الأدنى من النخاع. قسم الأنسجة القشرية إلى شرائط بعرض ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات على طول المبيض. لتجميد أنسجة المبيض ، ضع شريطا قشريا واحدا في كل قارورة مبردة مبردة تحتوي على محلول التجميد.
هز القوارير المبردة التي تحتوي على الشرائط القشرية على لوحة دوارة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نواة تشكيل بلورات الجليد عن طريق لمس كل قارورة تبريد بطرف قطني مغمور لفترة وجيزة في النيتروجين السائل. تم جمع خلايا المبيض وفرز كسور الخلايا من الجريبات الغارية FACS إلى أكثر من 95٪ نقاء.
تم تصنيف خلايا CD99 الحبيبية المسماة على وجه التحديد في PVRL1 ، أو النيكتين ، بشكل متزايد في حجرة خلايا البويضة الحبيبية مع زيادة حجم الجريبات الغريبة. وقد لوحظ أن الأجسام المضادة ضد endoglin أو CD55 حددت على وجه التحديد جميع خلايا السدى والثيكا وأن ألانين أمينوببتيداز تم التعبير عنه على وجه التحديد بواسطة خلايا الثيكا الأندروجينية. تم تمييز الخلايا بجسم مضاد موجه ضد CD99 لتحديد الخلايا الحبيبية وتم استخدام الأجسام المضادة ضد CD45 لاستبعاد الخلايا المكونة للدم.
فصلت الأجسام المضادة ضد PVRL1 عدد الخلايا الحبيبية إلى مقصورات البويضة والجدارية. بعد الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز ديسباز ، مكنت مستحضرات الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة ضد CD55 و CD34 وألانين أمينوببتيداز من التقاط جميع خلايا السدى أو الثيكا أو خلايا الثيكا الأندروجينية مع استبعاد الخلايا البطانية من مجموعات خلايا ثيكا. توخ الحذر بشكل خاص لتجنب تعطيل غار البصيلات أثناء عزل الجريب الأولي عن طريق القطع داخل هامش آمن حول حدود الجريب.
في نهاية هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا للتحليل الجزيئي أو التشخيصي أو بدلا من ذلك يتم استزراعها في المختبر لدراسات السموم أو التحليل التجريبي أو تلخيص البيئة المكروية للجريب. حتى الآن ، تم استخدام هذه الطرق لنمذجة اضطرابات الغدد الصماء التي تنطوي على المبيض وتحديد مجموعات فرعية جديدة من الخلايا المرتبطة بالجريب.
