مع مزيج بسيط من المكونات والأسطح الوظيفية ، يعيد هذا البروتوكول إنشاء وظيفة حيوية للخلايا ، وهي حركة مدعومة بتجميع الأكتين. يمكن تقييم الآليات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لإنتاج القوة عن طريق تغيير مزيج المكونات وخصائص السطح الوظيفي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكن شراء جميع المكونات ، لذلك الخبرة في تنقية البروتين ليست ضرورية.
هذا يسمح لغير المتخصصين باستخدام هذا النظام كأداة في أبحاثهم. يوفر هذا البروتوكول وحدة تعليمية على مستوى المرحلة الجامعية ، مما يمنح الطلاب خبرة عملية في معالجة البروتينات ومراقبة نظام بيولوجي معد ذاتيا تحت المجهر. يمكنهم التحكم في معلمات النظام وتغييرها.
يمكن إجراء التحليل الفيزيائي ، مثل معادلة Langmuir ، على المسارات. ابدأ بإعادة تعليق البروتينات المجففة بالتجميد. اجمع المادة الصلبة في قاع الأنبوب عن طريق مساحيق البروتين بالطرد المركزي النبضي عند أربع درجات مئوية.
ثم أضف الماء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة واحتضنه على الثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل. تخلط بلطف عن طريق ماصة العين. احتفظ بها على الجليد لمدة 15 دقيقة أخرى واخلطها مرة أخرى.
جمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الطرد المركزي. ريمكس ، والقسمة على الجليد. لإزالة بلمرة أوليغومرات الأكتين المتكونة أثناء التجفيد والتجميد ، قم بتخفيف حصة الأكتين المعاد تعليقه ثمانية أضعاف في G-buffer مع ATP و DTT و 10٪ من الأكتين الموسوم.
اتركه يتحلل من البلمرة على الثلج مع الخلط العرضي لبضعة أيام على الأقل إلى أسبوع قبل قياس تركيز البروتين. لقياس تركيزات البروتين للبروتينات المعاد تعليقها ، قم أولا بإعداد سلسلة تخفيف BSA. ابدأ بوضع أنبوبين ملليلتر و 1.5 ملليلتر في الرف كما هو موضح في المخطوطة.
املأ أنبوبا مخروطيا سعة 15 ملليلترا إلى الأعلى بكاشف برادفورد وضعه على الجليد. خذ 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد وأخرجه مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي لتبليل طرف الماصة. نظرا لأن المحلول لزج ، ماصة ببطء للسماح للمحلول بالدخول وترك الطرف تماما دون تكوين فقاعات.
ثم باستخدام الطرف الرطب مسبقا ، ماصة 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد في كل من الأنابيب 1.5 ملليلتر في الرف. وأعد المحتوى المتبقي من الأنبوب المخروطي 15 ملليلتر إلى الزجاجة. قم بقياس الماء في أنبوبي الملليلتر في الصفوف الأول والثالث والخامس.
قم بإعداد سلسلة تخفيف BSA عن طريق تخفيف محلول مخزون BSA المعاير كما هو موضح في المخطوطة. ثم قم بإجراء تخفيفات تسلسلية عن طريق نقل 900 ميكرولتر من كل محلول إلى الأنبوب التالي. أضف 800 ميكرولتر من الماء إلى أنبوب كاشف برادفورد للفراغ وابدأ تشغيل المؤقت.
امزج 800 ميكرولتر من كل معيار BSA مع 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد في الأنابيب المعدة. في غضون خمس دقائق بعد الخلط مع كاشف برادفورد أو كل معيار في كوفيت يمكن التخلص منه ، اقرأ الامتصاص عند 600 نانومتر. رسم بياني لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها كدالة لتركيز BSA المعروف والحصول على ارتباط خطي بقيمة R 0.99.
في الأنابيب التي تحتوي على 2000 ميكرولتر من الماء ، قم بتخفيف البروتينات القابلة للذوبان بلطف كما هو موضح في المخطوطة. أضف على الفور 800 ميكرولتر من كل محلول إلى كاشف برادفورد المحضر واخلطه. اقرأ الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي في غضون خمس دقائق.
احسب تركيزات البروتين باستخدام المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقا. لطلاء حبة ، قبل تبريد جهاز الطرد المركزي إلى أربع درجات مئوية. ماصة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت Xb في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
قم بخلط تعليق حبة قطرها 4.5 ميكرومتر جيدا عن طريق الدوامة وإضافة تسعة ميكرولتر من التعليق إلى الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت Xb. أجهزة الطرد المركزي العينات في 20،000 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لطلاء الخرز ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز وأعد تعليق حبيبات الخرزة في 40 ميكرولتر من اثنين من ميكرومولار SpVCA في المخزن المؤقت Xb عن طريق السحب برفق.
الآن حرك الخرز في الكتلة الجافة عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 18 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الخرز المطلي بالطرد المركزي. إزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من Xb البارد مع 1٪ BSA.
بعد غسل الخرز ، أعد تعليق حبيبات الخرزة المطلية في 120 ميكرولتر من Xb البارد ، 1٪ BSA. تخزينها على الجليد في الثلاجة أو غرفة باردة. تحضير خليط تفاعل الحركة كما هو موضح في المخطوطة.
امزج التفاعل بسرعة وابدأ المؤقت. اكتشف خليط تفاعل الحركة بالكامل على شريحة. قم بتغطيتها بغطاء 18 مم × 18 مم وأغلق غطاء الغطاء باستخدام VALAP المذاب باستخدام فرشاة طلاء صغيرة.
للحصول على متوسط سرعات الإزاحة لمجموعة كاملة من الخرز، قم بتسجيل تباين الطور أو الصور الثابتة الفلورية بمرور الوقت عن طريق مسح الشريحة بأكملها. قياس طول المذنب باليد وتسجيل القيم. ارسم طول المذنب مقابل الزمن.
ميل الملاءمة الخطية هو متوسط سرعة النمو. حدد أفلام الفاصل الزمني في الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم سرعات الخرزة الفردية. اعتمادا على سرعة الخرزة والدقة المطلوبة ، خذ إطارات كل 1 إلى 10 ثوان.
استخدم أداة التتبع لأي برنامج لمعالجة الصور للحصول على سرعات ومسارات الخرز. خلط معايير BSA مع كاشف برادفورد يعطي حلا بألوان زرقاء متدرجة. يتم رسم قيم الامتصاص مقابل تركيزات البروتين القياسية ويتم استخدام الارتباط الخطي لتحديد تركيزات البروتين المعاد تعليقه.
يؤدي خلط الخرز المشفر SPVCA ووسط الحركة الذي يحتوي على بروتين السد إلى تكوين سحابة الأكتين في غضون دقائق. يحدث استقطاب السحب في حوالي خمس دقائق وإنتاج المذنبات في 15 إلى 20 دقيقة. تستمر مذنبات الأكتين في الاستطالة لعدة ساعات ولكن لا يتم الحفاظ على سرعة ثابتة.
لذلك يتم تقييم حركة حبة في غضون ساعة واحدة. مزيج الحركة مع إما بروتين السد أو الجلسولين يعطي المذنبات بطريقة مماثلة. تستقطب سحب الأكتين لتكوين مذنبات في أول 20 دقيقة من التفاعل وتستطيل المذنبات بمرور الوقت.
يستخدم تقييم أطوال المذنبات المقاسة بمرور الوقت لحساب سرعة الإزاحة. في غياب نشاط السد ، تتشكل سحب الأكتين حول الخرز ، لكن تكوين المذنب لا يحدث. يعد التعامل الدقيق مع البروتينات وسحبها أمرا ضروريا لنجاح هذا الإجراء ، ليس فقط عند صنع مزيج الحركة ، ولكن أيضا عند قياس تركيزات البروتين باستخدام اختبار برادفورد.
يسمح تكوين المذنبات ومسارات الخرز التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول بفهم الآلية الفيزيائية للحركة باستخدام تحليل المادة اللينة والفيزياء الإحصائية والتجارب الفيزيائية الحيوية ، بما في ذلك قياسات القوة والمعالجة الدقيقة.
