يجعل عملنا جهود إعادة تكوين الهيكل الخلوي خطوة مهمة أقرب إلى محاكاة الظروف الخلوية من خلال هندسة مركبات الأكتين والأنابيب الدقيقة ، مدفوعة بمحركات كينيسين وميوسين لضبط وإعادة الهيكلة والتحرك بنشاط. يمكن برمجة ديناميكيات وهيكل مركباتنا بدقة عن طريق إضافة المكونات المختلفة وإزالتها وضبطها بشكل مستقل لإظهار قاعدة طور غنية من الانكماش والعدوى وإزالة الضباب والخشونة والتمزق. نهجنا قابل للتطبيق على نطاق واسع لتصميم وإنشاء وتوصيف منصات المادة النشطة التي تتضمن مكونات متعددة لتوليد القوة تعمل على ركائز مختلفة في نظام واحد.
سيوضح الإجراء ديزي أشيريلواي ومايا هنديجا. الباحثون الجامعيون من مختبرنا. للبدء ، أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي صغير أسود معقم سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة صغيرة وأطراف ماصة معقمة لتشكيل مجموعات محركات Kinesin التي تربط وتمارس القوى بين أزواج الأنابيب الدقيقة.
امزج بلطف عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. ثم احتضان الحل لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وحمايته من الضوء. لتحضير شبكة مركبة متشابكة من خيوط الأكتون والأنابيب الدقيقة ، اضبط كتلة الحرارة على 37 درجة مئوية.
أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 0.6 ملليلتر. تأكد من أن الحجم الكلي هو 25 ميكرولتر. ماصة بلطف المحلول لأعلى ولأسفل لخلطه ووضعه على كتلة حرارية 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة واستخدم ماصة صغيرة لخلط 0.84 ميكرولتر من 100 ميكرومولار Phalloidin. احتضان لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. لتحضير المركبات النشطة للتصوير البؤري ، أضف الكواشف إلى المحلول واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
قسم المحلول إلى ثلاثة حصص 10 ميكرولتر وقم بتسميتها ك K و K زائد M والتحكم السالب. أضف 2.54 ميكرولتر من الميوسين إلى القسمة K زائد M و2.54 ميكرولتر من PEM إلى K وحصة التحكم السالبة. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من مجموعات Kinesin إلى K و K بالإضافة إلى حصص M والماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
بعد ذلك ، أضف 2.5 ميكرولتر من PEM إلى عنصر التحكم السلبي باستخدام نفس التقنية. استخدم ماصة دقيقة لتدفق كل محلول ببطء إلى القناة المقابلة لغرف العينة عن طريق العمل الشعري. ادفع لأسفل ببطء شديد وبرفق على الماصة حتى لا تدخل فقاعات الهواء في القناة.
أغلق الطرفين المفتوحين لكل قناة بإيبوكسي سريع الجفاف أو غراء قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية. عندما تجف المادة اللاصقة تماما ، ضع القناة على المجهر لتصوير المركب بالقرب من الحالة الأولية غير النشطة قدر الإمكان. قم بتصوير قناة K وقنوات K plus M أولا متبوعة بقناة التحكم.
لاحظ الوقت المنقضي بين إضافة مجموعات Kinesin إلى K و K بالإضافة إلى M aliquots وبداية الحصول على البيانات. لتحضير الأكتين إلى روابط متشابكة للأكتين أو AA ، أضف البيوتين-أكتين ونيوترافيدين والبيوتين و PEM إلى أنبوب طرد مركزي صغير واخلطهم برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. وبالمثل ، بالنسبة للأنابيب الدقيقة إلى الأنابيب الدقيقة أو الروابط المتشابكة MM ، أضف Biotin-tubulin و NeutrAvidin و Biotin و PEM إلى أنبوب طرد مركزي صغير واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
لف الأنبوب في فيلم سقف لدن بالحرارة لإنشاء ختم مانع لتسرب الماء وضعه في طوف تعويم في حمام سونيكاتر يتم التحكم في درجة حرارته ، مضبوطا على أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. لدمج مجمعات A-A crosslinker في عينات للتصوير ، أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي صغير. تأكد من أن الحجم الكلي هو 25 ميكرولتر.
وبالمثل ، بالنسبة لمجمعات M-M crosslinker ، أضف الكواشف الموضحة على الشاشة إلى أنبوب طرد مركزي صغير. امزج المحلول عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وضعه على كتلة حرارية 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة واستخدم ماصة صغيرة لخلط 0.84 ميكرولتر من 100 ميكرومولار Phalloidin.
احتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء وكرر الإجراء الموضح سابقا لإعداد المركبات النشطة للتصوير متحد البؤر. يتم بلمرة ألياف أكتين أحادية وثنائيات توبولين لتشكيل شبكات متشابكة من خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة. يقوم خيطان صغيران الميوسين ومجموعات كينسين بدفع الخيوط وسحبها لإخراج المركبات من الحالة المستقرة.
يتم تحقيق الربط المتقاطع السلبي باستخدام NeutrAvidin لربط خيوط الأكتين الحيوية أو الأنابيب الدقيقة. يتم دمج خيطين صغيرين من الميوسين ، أو مجموعات Kinesin ، أو كلا المحركين في مركبات بدون روابط متقاطعة سلبية ، وروابط متقاطعة للأكتين وأكتين ، ووصلات متقاطعة للأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة. يوضح هنا تصويران متحدا البؤر ملونان لمركبات الهيكل الخلوي المدفوعة بالميوسين بتركيزات مختلفة من الميوسين وكسور الأكتين المولاري.
يوضح قياس سرعة صورة الجسيمات أن نشاط الميوسين الأكتين يحفز ديناميكيات انقباضية منسقة للأكتين والأنابيب الدقيقة في المركبات المتشابكة. هنا ، تتوافق ألوان الأسهم المختلفة مع سرعات مختلفة كما هو موضح في مقياس الألوان على يمين حقول المتجه. يتم إجراء الفحص المجهري الديناميكي التفاضلي الذي تم حله زمنيا على قنوات الأنابيب الدقيقة والأكتين للسلاسل الزمنية لتحديد خصائص أوقات الاضمحلال مقابل رقم الموجة لكل من الأكتين والأنابيب الدقيقة.
يتم تحديد سرعات الانكماش من خلال منحنيات زمنية مناسبة للاضمحلال ، ويتم حساب متوسطها على مدار جميع أوقات التأخير طوال مدة كل سلسلة زمنية مدتها 45 دقيقة. يحدد الفحص المجهري الديناميكي التفاضلي الذي تم حله بالوقت كيف تتغير الديناميكيات بمرور الوقت من خلال تقييم أوقات الاضمحلال لفترات متتالية مدتها ست دقائق خلال وقت التنشيط البالغ 45 دقيقة للأكتين والأنابيب الدقيقة. يتم تحديد سرعات الانكماش التي تم حلها زمنيا لخيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة من النوبات إلى منحنيات وقت الاضمحلال المقابلة.
يحدد تحليل الارتباط التلقائي للصورة المكانية إعادة الهيكلة الحركية للمكونات الهيكلية الخلوية النشطة من خلال مقارنة منحنيات الارتباط التلقائي للشبكات المختلفة في بداية التجربة مقارنة بالنهاية. تظهر أطوال الارتباط التي تم حلها زمنيا والتي يتم تحديدها من خلال النوبات الأسية لمنحنيات الارتباط التلقائي المركبات التي لا يتم إعادة هيكلتها مقارنة بتلك التي تعيد الهيكلة بشكل كبير. تظهر صورتان متحدتا البؤر لونيتان لمركبات الأنابيب الدقيقة الأكتين المدفوعة ب Kinesin إعادة هيكلة تعتمد على التركيب بمرور الوقت دون إعادة هيكلة مركبات الروابط المتشابكة إلى مجموعات غنية بالأنابيب الدقيقة متصلة بشكل فضفاض.
يدعم الربط المتقاطع بين الأكتين والأكتين التوطين المشترك للأنابيب الدقيقة الأكتين ، بينما يعزز الربط المتقاطع بين الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة الخلط D. يظهر المجهر الديناميكي التفاضلي وتحليل الارتباط التلقائي للصور المكانية تأثير محركات الميسين والكينسين المتقاطعة والمتنافسة على ديناميكيات وهيكل المركبات المتغيرة زمنيا. لتقليد الظروف الخلوية عن كثب ، يمكن للباحثين دمج خيوط وسيطة ومحركات أخرى وبروتينات ملزمة تتحكم في أطوال الخيوط وصلابتها.
يمكن أيضا إجراء قياسات مقاييس الملقط البصري لتوصيف الميكانيكا المركبة. باستخدام نهجنا ، يمكن للباحثين ضبط ديناميكيات وهيكل المادة النشطة المركبة المستوحاة من الهيكل الخلوي بدقة عبر مساحة طور غير مسبوقة لمحاكاة العمليات الخلوية المتنوعة وهندسة المواد القابلة للبرمجة القابلة لإعادة التكوين.
