تعالج هذه الطريقة التحديات في مراقبة التألق العميق في براعم الأرز ، مثل اختراق الأنسجة المحدود لمحلول التطهير والدقة الحقيقية تحت المجهر البؤري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مراقبة بنية الكثير من الأنسجة الكبيرة من منظور ماكرو ، حتى المطالبات بالأنسجة الصلبة والسميكة ، مثل البراعم البالغة. تنطبق هذه الطريقة على التصوير العميق للأنسجة الصلبة والسميكة في الأنواع النباتية الواسعة.
يمكن أن يساعد في تسريع اكتشاف ظواهر جديدة في البحوث البيولوجية النباتية. للبدء ، قم بقطع الجذور بعناية دون الإضرار بالنباتات واغسلها بالماء لإزالة الأوساخ. الآن ، استخدم الملقط لتقشير الأوراق الخارجية القديمة.
لتجنب سحق الخلايا ، استخدم ماكينة حلاقة ذات حافة واحدة بحركة منزلقة لقطع الأنسجة من اللقطة أو المريستم القمي أو الذعر الصغير إلى القاعدة. إذا كان موضع meristem القمي تبادل لاطلاق النار أو الذعر الشباب غير مرئي ، فقم بقصه لفترة أطول. تبادل لاطلاق النار الأرز لديه مقطع عرضي بيضاوي.
استخدم ماكينة حلاقة ذات حدين لحلق جانب واحد من البيضاوي بشكل رقيق ، في اتجاه محوره الطويل. تأكد من موضع meristem القمي تبادل لاطلاق النار أو الذعر الشباب من خلال ظهور لون أبيض في العينة وتقليم الأنسجة الزائدة. ضع العينة في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول مثبت.
قطع قطعة 2.5 سنتيمتر مربع من فيلم البارافين وتشكيلها في كرة. الآن ، ضع هذه الكرات فوق العينات لمنعها من الطفو خارج المحلول المثبت. ضع الأنبوب الذي يحتوي على العينة في مجفف.
أغلق غطاء المجفف وابدأ تشغيل مضخة التفريغ لتخفيف الضغط ببطء داخل المجفف حتى يتم الوصول إلى ضغط ناقص 0.095 ميجاباسكال. بعد إغلاق المجفف عند 0.095 ميجاباسكال تحت الصفر ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ واتركها تقف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افتح المجفف قليلا وأعده ببطء إلى الضغط الجوي.
إذا تم إصلاح العينة بشكل صحيح ، فإنها تغرق في الحل المثبت. وإذا لم تغرق ، قلل الضغط مرة أخرى. إزالة فيلم البارافين.
أغلق الغطاء، واحتفظ بالأنابيب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. باستخدام مناديل خالية من الوبر، قم بإزالة المحلول المثبت الزائد من العينة وقم بتثبيت العينة على درج تقطيع دقيق يهتز باستخدام الغراء الفوري. ضع العينة على صينية مع الجانب المسطح لأسفل والتي تم حلقها أثناء أخذ العينات وقم بتعيين ظروف التشذيب وفقا للعينة الثابتة.
اضبط موضع العينة باستخدام الزر الخلفي أو الأمامي والزر لأعلى أو لأسفل واملأ الدرج بالماء منزوع الأيونات حتى يتم غمر جميع العينات. بعد ملء الدرج ، اضغط على زر البدء ووضع العينات المشذبة على شريحة زجاجية مع قطرة من PBS. تحقق من العينة التي تحتوي على الموقع المستهدف تحت مجهر ستيريو وانقل العينة المشذبة إلى صفيحة متعددة الآبار مع ملليلتر واحد من PBS.
قم بإزالة PBS من اللوحة متعددة الآبار. أضف PBS طازجا واتركه يقف لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة PBS وإضافة CS. ضع اللوحة متعددة الآبار التي تحتوي على العينة في مجفف وأغلق الغطاء.
ثم ابدأ تشغيل مضخة التفريغ لتخفيف الضغط من داخل المجفف حتى ناقص 0.09 ميجاباسكال ، ببطء. بعد إغلاق المجفف عند 0.09 ميجاباسكال تحت الصفر ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ واتركها تقف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. افتح المجفف قليلا وأعده ببطء إلى الضغط الجوي.
صب الماء منزوع الأيونات في الفجوة بين الآبار لمنع تبخر CS وتخزين الألواح متعددة الآبار في درجة حرارة الغرفة في الظلام للتطهير. عندما يتحول CS إلى اللون الأخضر ، استبدله بمحلول جديد. ظلت العينات غير المشذبة خضراء ولم تصبح شفافة بعد ثلاثة أشهر من العلاج CS.In العينات التي تم تقشيرها من جميع الأوراق تحولت العقد الداخلية إلى اللون الأبيض بعد أسبوع واحد ، على الرغم من أن العقد ظلت خضراء.
لم تصبح العينة شفافة بعد أربعة أسابيع. أصبحت العينات المشذبة يدويا بيضاء بعد أسبوع واحد من علاج CS ولكنها لم تصبح شفافة بعد أربعة أسابيع. أصبحت العينات التي تم تقليصها إلى سمك 130 ميكرومتر شفافة بعد أسبوع واحد من معالجة CS.
كانت العينة شفافة تقريبا بعد أسبوعين. في العقدة ، كان العمق الذي يمكن ملاحظته بعد أسبوع واحد من علاج CS ناقص 60 ميكرومتر وناقص 90 ميكرومتر بعد أسبوعين. لوحظت إشارات الفلورسنت على عمق ناقص 80 ميكرومتر في ثلاثة أسابيع وعلى عمق ناقص 100 ميكرومتر في أربعة أسابيع.
في العقدة الداخلية ، لوحظت إشارات الفلورسنت على عمق ناقص 60 ميكرومتر دون معالجة CS. كان العمق الذي يمكن ملاحظته ناقص 90 ميكرومتر بعد أسبوع إلى ثلاثة أسابيع من علاج CS وناقص 100 ميكرومتر بعد أربعة أسابيع. في الأوراق لوحظت إشارات الفلورسنت على عمق ناقص 90 ميكرومتر دون معالجة CS ، ولكن السطوع كان أضعف من الأنسجة الأخرى.
بعد أسبوع واحد ، كانت الإشارات أكثر إشراقا ولوحظت على عمق ناقص 120 ميكرومتر. لوحظ التعبير عن عامل النسخ OS MASU 15 mOrange في Panicle الشباب ، ورقة ، عقدة ، internode ، و fleurette. المفتاح هو العثور على أفضل الظروف للنباتات أو الأنسجة ، على سبيل المثال ، ضغط الفترة والفراغ ، أو الموضع ، ومعالجة CS ، والتوقيت ، والسمك ، والسرعة ، وحل التلطيخ المناسب.
يسمح الجمع بين التوقيت وتكنولوجيا المعالجة بالمراقبة الزمنية المكانية لنمط التعبير الجيني والتواصل بين الخلايا في أنسجة متعددة من قسم واحد.
