هوانغ لونغ بينغ ، يختصر باسم HLB. إنه مرض حمضيات مدمر في جميع أنحاء العالم. في معظم البلدان المنتجة للحمضيات ، مثل الصين والولايات المتحدة الأمريكية ، يحدث HLB بسبب البكتيريا المقيدة باللحاء Candidatus Liberibacter asiaticus ، والمختصرة باسم CLas.
كان الكشف المبكر عن CLas مهما للمزارعين لتسهيل التدخل المبكر ومنع انتشار المرض. لذلك قمنا هنا بتطوير طريقة جديدة لتشخيص HLB السريع والمحمول ، جنبا إلى جنب مع تضخيم بوليميراز recombinase ونظام CRISPR-Cas12a. أطلقنا عليه اسم CLas-DETECTR.
حساسية منصتنا أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، فإنه يظهر نتيجة مماثلة مع qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع اكتشافات CLas التقليدية ، يمكن الانتهاء من طريقتنا في 90 دقيقة ، وتعمل في حالة متساوية الحرارة.
يمكن أيضا تصور النتيجة من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان. يحتوي CLas-DETECTR على أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، ونتائج التصور. يتم توضيح الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR هنا.
يتم إعداد المخزن المؤقت A والحل B والحل C كما هو موضح في البروتوكول. لتوفير الوقت وجعل هذه الطريقة مناسبة للكشف عن CLas الميداني ، تم استخدام النهج القائم على E.coli البولي إيثيلين جلايكول للحصول على مستخلصات نباتية خام لتضخيم الحمض النووي. تستخدم أوراق الحمضيات في الأداة.
لكمة القطع القليلة من أقراص الأوراق من ورقة. ضع أقراص الأوراق في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت أ إلى الأنبوب.
طحن أقراص ورقة حتى تصبح ناعمة مع قضيب من البلاستيك يدويا. اترك الأنبوب دون إزعاج لمدة 10 دقائق. يتم تطبيق الطافي لاحقا على تضخيم الحمض النووي.
لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، أضف ميكرولترا واحدا من المادة الطافية من الخطوة 2.3 وميكرولترا واحدا من أسيتات المغنيسيوم إلى المحلول B واخلطه جيدا. في المختبر ، احتضنهم في حاضنة بسيطة عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة. لتصور النتائج ، أضف 10 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 3.2 إلى المحلول C واخلطه جيدا.
احتضانها في حاضنة 37 درجة لمدة 60 دقيقة. ارتد نظارة واقية ، وراقب إشارة التألق الخضراء من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد. لاختبار خصوصية CLas-DETECTR ، أول مستعمرات نقية من Agrobacterium tumefaciens GV3101 ، Xanthomonas citri subsp.
تم استخدام الستري وهو العامل الممرض لقرحة الحمضيات وسلالة Burkholderia stabilis 1440 المعزولة في مختبرنا لاستخراج الحمض النووي الجينومي. ثم خضع هذا الحمض النووي الجينومي للبكتيريا الثلاثة والحمض النووي الجينومي لأوراق نيوهول الإيجابية CLas لاختبار CLas-DETECTR. لاختبار حساسية CLas-DETECTR ، تم الكشف عن سلسلة من تخفيفات شظايا الحمض النووي CLas باستخدام PCR و CLas-DETECTR و qPCR كما هو موضح في البروتوكول بعد اختبار الخصوصية والحساسية ، تم استخدام طريقة CLas-DETECTR للكشف عن وجود CLas في الحقل.
عينات أوراق تم جمعها من شجرة البرتقال الحلو في نيوهول المزروعة في مشتل موارد الأصول الوراثية في حرم جامعة جانان نورمال ، جيانغشي ، الصين. كما تم تطبيق qPCR ، وهي طريقة مقنعة للكشف عن CLas تستخدم عادة في المختبر. تم إخضاع عينات الأوراق من شجرة نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB ، والتي تم فيها تأكيد وجود CLas في مختبرنا ، لاختبار CLas-DETECTR.
تم التقاط إشارة التألق الخضراء في العينة المصابة ب HLB ، ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والسيطرة السلبية. حددنا خصوصية CLas-DETECTR باستخدام الأحماض النووية المستخرجة من البكتيريا الأخرى. في مقايسة CLas-DETECTR ، أظهر gDNA فقط المستخرج من أوراق نيوهول الإيجابية CLas إشارات فلورية خضراء.
gDNA المستخرج من Agrobacterium tumefaciens GV3101 و Xanthomonas citri subsp. citri و Burkholderia stabilis strain 1440 لم يفعل ذلك ، مما يعني أن CLas-DETECTR يمكنه اكتشاف CLas على وجه التحديد. اختبرنا أيضا حساسية CLas-DETECTR باستخدام سلسلة من تخفيفات الحمض النووي CLas ، المدرجة في البروتوكول.
يمكن ل PCR اكتشاف 201 نسخة لكل ميغالتر. من ناحية أخرى ، يمكن ل CLas-DETECTR اكتشاف 2.01 نسخة لكل ميغالتر ، مما يشير إلى توفره كتشخيص مجال حساس. يمكن ل qPCR اكتشاف 0.201 نسخة لكل ميغالتر وقيمة Ct أعلى من 36.
لذا فإن CLas-DETECTR هو أمران من حيث الحجم أكثر حساسية من PCR التقليدي وترتيب واحد من حجم أقل حساسية من qPCR عند استخدام مضخمات CLas المحددة المخففة. أخيرا ، إعادة فحص جدوى كاشف CLas-DETECTR للعينات الميدانية ، ومقارنة حساسيته مع qPCR. في الأرقام ، نرى.
يمكننا ملاحظة أن قيمة Ct أعلى من 36 عندما يكون تركيز CLas أقل من 0.2 نسخة لكل ميغالتر، وهو تركيز منخفض جدا. من بين العينات ال 15 ، كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينات 1 و 2 و 3 و 4 و 8 و 10 و 13 و 14 المكتشفة بواسطة qPCR أقل من 36. لوحظت إشارات مضان خضراء واضحة.
من ناحية أخرى ، عندما لم يتم تحديد قيمة Ct للعينات 6 و 7 و 9 و 12 و 15 التي تم اكتشافها بواسطة qPCR ، لم تلاحظ أي إشارات فلورية خضراء. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت إشارات فلورية خضراء ضعيفة عندما كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينة 5 و 11 المكتشفة بواسطة qPCR أعلى من 36. ستشير النتائج إلى أن منصتنا هي أداة سريعة وقوية وحساسة لتشخيص HLB في هذا المجال.
