يمكن استخدام هذا البروتوكول لقياس عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا الموجودة في الخلايا الفردية بدقة ومستوى أنواع معينة من طفرة الحمض النووي للميتوكوندريا. يمكن للطرق السابقة إجراء هذه القياسات بدقة في عينات الأنسجة التي تحتوي على العديد من الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إجراء نفس القياسات في خلايا مفردة.
هذه الطريقة ذات فائدة خاصة لأولئك الذين يدرسون الميتوكوندريا وسيكون لها تطبيقات واسعة في هذا المجال. العزل الفعال وتحلل الخلايا المفردة هو مفتاح هذه التقنية. الخبرة السابقة مع فرز خلية واحدة ستكون مفيدة للغاية.
للبدء ، قم بإعداد المزيج الرئيسي ل PCR بدون عينة الحمض النووي على الجليد ، كما هو موضح في النص. بعد الدوامة لفترة وجيزة ، قم بتوزيع الحجم المطلوب من المزيج الرئيسي المحضر على كل بئر من لوحة PCR 96-well من جيل القطرات ، مع ترتيب العينات في أعمدة كاملة. بعد ذلك، أضف المزيج الرئيسي إلى أي بئر فارغ في أعمدة غير مكتملة لاستخدامها كعناصر تحكم غير قالب.
ثم أضف الحمض النووي المدخلات إلى كل بئر لجعل الحجم الإجمالي لكل بئر 22 ميكرولتر. أغلق اللوحة بختم لوحة لاصقة وضعها على شاكر عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بالطرد المركزي للصفيحة بسرعة 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية قبل وضعها على الجليد.
بالنسبة لتوليد القطيرات، تأكد أولا من تشغيل مولد القطيرات وتحقق مما إذا كانت زجاجة من زيت توليد القطرات يتم تحميلها في الموضع E من سطح الجهاز. ثم انقر فوق تكوين لوحة العينة على الشاشة التي تعمل باللمس. بعد تحديد جميع الأعمدة الموجودة على لوحة العينة التي تحتوي على العينات أو الفراغات ، انقر فوق موافق لتأكيد تكوين اللوحة.
بعد ذلك ، قم بتحميل خراطيش مولد القطيرات لوضع B على سطح الجهاز بحيث تتحول جميع الأضواء إلى اللون الأخضر ووضع حوض نفايات الطرف الفارغ في الموضع C.ثم قم بتحميل صناديق أطراف المرشح مع إزالة الأغطية لوضع D على مرحلة الأداة بحيث تتحول جميع الأضواء إلى اللون الأخضر. بعد ذلك ، قم بإزالة الختم اللاصق قبل تحميل لوحة العينة لوضع F من سطح الأداة بحيث يتحول الضوء إلى اللون الأخضر. قم أيضا بتحميل صفيحة فارغة من مجموعة القطرات 96 بئرا موضوعة في كتلة باردة ، مبردة مسبقا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر ، في الموضع G بحيث يتحول الضوء إلى اللون الأخضر.
انقر فوق بدء توليد القطيرات على شاشة اللمس الخاصة بالجهاز وسيتم إغلاق غطاء مولد القطيرات تلقائيا. بمجرد اكتمال توليد القطيرات ، تحقق من لوحة جمع العينات بصريا للتأكد من وجود طبقة مستحلب قطرات فوق مرحلة الزيت في كل بئر. بعد ذلك ، قم بتشغيل مانع تسرب اللوحة واضبط درجة الحرارة على 180 درجة مئوية ووقت الختم على خمس ثوان.
اسمح للماكينة بالوصول إلى درجة حرارة التشغيل. ثم ضع لوحة جمع العينات على حامل اللوحة الخاص بمانع تسرب اللوحة وضع ختم رقائق جديد في الجزء العلوي من اللوحة مع توجيه الخط الأحمر لأعلى. عندما يصل مانع تسرب اللوحة إلى درجة حرارة التشغيل، اضغط على مفتاح الإخراج على شاشة اللمس الخاصة بالجهاز.
بعد وضع حامل اللوحة في درج مانع تسرب اللوحة، اضغط على ختم لإغلاق الدرج. بمجرد اكتمال الختم ، سيتم فتح الدرج تلقائيا. قم بإزالة اللوحة المختومة وضعها على الكتلة الباردة.
ثم قم بإيقاف تشغيل مانع تسرب اللوحة. لتشغيل PCR ، ضع لوحة جمع القطرات المختومة في آلة PCR مع كتلة بئر عميقة 96. بعد اكتمال PCR ، قم بتشغيل قارئ القطيرات والكمبيوتر المتصل.
قم بتحميل اللوحة بعينات ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في حامل لوحة قارئ القطيرات. مع الحفاظ على غطاء الرقائق على لوحة العينة، ضع الغطاء في الجزء العلوي من الحامل وقم بتثبيته في مكانه باستخدام مشابك قفل سوداء. بعد ذلك ، لفتح غطاء قارئ القطيرات ، اضغط على زر فتح / إغلاق.
ثم قم بتحميل حامل لوحة قارئ القطيرات مع لوحة العينة في غرفة القارئ وضعه بشكل آمن على القاعدة المغناطيسية. اضغط على زر فتح/إغلاق مرة أخرى لإغلاق الغطاء. افتح واجهة برنامج التحليل.
حدد علامة التبويب إضافة لوحة، وانقر فوق إضافة لوحة، ثم قم بتكوين اللوحة. في علامة التبويب معلومات اللوحة، أدخل اسم لوحة، وحدد Supermix for Probes، No DUTP من القائمة المنسدلة Supermix، وأدخل اسم ملف ضمن حفظ ملف البيانات As.In علامة التبويب اختيار البئر، وقم بتمييز الآبار المراد تحليلها وانقر فوق تضمين الآبار المحددة. ثم في علامة التبويب معلومات الآبار ، حدد الآبار المراد التعليق عليها.
حدد القياس الكمي المباشر من القائمة المنسدلة نوع التجربة. ثم قم بتعبئة وصف العينة ونوع العينة ومربعات الأسماء المستهدفة، وأضف ملاحظات جيدة و/أو ملاحظات لوحة كما هو مطلوب. ثم انقر على تطبيق.
بمجرد اكتمال تكوين اللوحة، انقر فوق بدء التشغيل. لتحليل النتائج، حدد علامة التبويب تحليل البيانات وافتح الملف المراد تحليله من القائمة ملفات البيانات الخاصة بي. ثم انقر فوق علامة التبويب 1D Amplitude للتجارب أحادية اللون، أو علامة التبويب 2D Amplitude للتجارب ذات اللونين.
بعد ذلك ، حدد الآبار التي تتطلب العتبة. استخدم أداة وضع خط العتبة لتطبيق العتبة يدويا في المساحة الواضحة بين المجموعات الإيجابية والسلبية على مخطط السعة، مما يضمن وضع التقاطع بحيث يتم فصل مجموعات القطرات الأربعة بوضوح. بمجرد تطبيق الحد الأدنى لجميع العينات ، قم بتصدير النتائج كملف csv لمزيد من التحليل بالنقر فوق علامة التبويب جدول البيانات ، استيراد / تصدير ، وتحديد تصدير البيانات المرئية إلى CSV.
أدخل اسم ملف مناسب وانقر على حفظ. أظهرت إجراءات PCR وقراءة القطيرات المستخدمة في هذا البروتوكول وجود مجموعات منفصلة بوضوح من القطرات الإيجابية والسلبية ، سواء في قنوات fam أو hex. يمكن أيضا تمييز مجموعات الحمض النووي للميتوكوندريا الإيجابية لكلا المسبارين عن الليزات أحادية الخلية.
أظهرت هذه الطريقة أيضا أنه بالنسبة للعينات التي تحتوي على حذف في الحمض النووي للميتوكوندريا ، توجد مجموعة مختلطة من القطرات الإيجابية المزدوجة والقطرات الإيجابية للجزء غير المحذوف فقط من الحمض النووي. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لحساب عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا لكل خلية في مجموعة متنوعة من خلايا الثدييات، بما في ذلك بويضات الفئران والخلايا الجنينية الأولية للفئران. علاوة على ذلك ، في الخلايا ذات الحذف العالي للبلازما ، وجد أن عدد السكان الإيجابي لمسبار واحد أكبر بكثير من السكان الإيجابيين المزدوجين.
ومع ذلك ، في الخلايا ذات التباين منخفض الحذف ، كانت كلتا المجموعتين متماثلتين في الحجم. لذلك تضمن النتائج الدقيقة دائما نجاح توليد القطيرات وأن العتبة قد تم تطبيقها بشكل مناسب باستخدام عرض السعة 1D أو 2D. يمكن استخدام الليزات غير المستخدمة في فحوصات الخلية الواحدة الأخرى ، مثل بيروسكوينك ، والتي يمكن أن تقيس تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة غير المتجانسة.
سمح لنا تطوير هذه التقنية بإجراء قياسات دقيقة لعدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا ، وحذف التباين في الخلايا الفردية ، وهو ما لم يكن ممكنا في السابق.
