يسمح هذا البروتوكول بإنشاء أنماط دقيقة عالية الدقة من البروتين بأي شكل مرغوب فيه ، ولا سيما الجزر المعزولة من النمط لدراسة مجموعات الخلايا. يمكن استخدام هذه التقنية لصنع أنماط صغيرة معزولة للجزر من أي شكل وحجم في خطوة واحدة فقط ، في حين أن صنع مثل هذه الأنماط سابقا كان يتطلب خطوتين منفصلتين. ابدأ بخلط PDMS في نسبة عامل المعالجة الصحيح إلى النسبة الأساسية كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.
احتضن في درجة حرارة الغرفة والضغط لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتفريغ الخليط تحت الفراغ لمدة 15 دقيقة. صب PDMS في القالب الرئيسي ونقله إلى حاضنة تم ضبطها على 37 درجة مئوية لعلاجها بين عشية وضحاها. قم بإزالة القالب الرئيسي من الحاضنة واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
بينما يبرد القالب الرئيسي ، فإن أغطية السونيكات 25 ملم تنزلق في الإيثانول لمدة 10 دقائق. استخدم أكبر عدد ممكن من الأغطية مثل عدد الطوابع التي يتم إعدادها. اشطف الأغطية جيدا بماء DI وجففها باستخدام مسدس هواء مفلتر.
عالج الأغطية بالبلازما لمدة دقيقة واحدة باستخدام منظف البلازما تحت مكنسة كهربائية عالية. حرر الفراغ ببطء بعد العلاج لمنع انزلاقات الغطاء من التحرك داخل الغرفة. قم بتغطية كل غطاء ب 100 ميكرولتر من محلول البروتين المسمى بالفلورسنت في غرفة خالية من أشعة الشمس المباشرة أو الإضاءة العلوية.
قم بتغطية العينات لحماية إضافية من الضوء واحتضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف كل قطعة غطاء جيدا بماء DI. قم بإزالة الماء الزائد من السطح عن طريق النقر بلطف على جوانب كل غطاء على منشفة ورقية أو مادة ماصة مماثلة.
اترك الأغطية لتجف تماما عن طريق تركها مكشوفة في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل. بينما تجف الأغطية المطلية بالبروتين ، قم بإزالة ختم PDMS من القالب الرئيسي عن طريق قطعه بمشرط أو أي شفرة حادة. عالج طوابع PDMS بالبلازما لمدة دقيقتين تحت فراغ عال.
ضع الطوابع في وعاء مع غطاء تحت غطاء الدخان ، ثم قم بتغطية كل ختم بطبقة رقيقة من 10٪ 3-APTMS المخففة في 100٪ إيثانول. قم بتغطية الحاوية بالطوابع واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. اشطف كل ختم جيدا على كلا الجانبين بماء DI.
ضع الطوابع في وعاء نظيف وقم بتغطيتها بنسبة 2.5٪ glutaraldehyde المحضرة في ماء DI. قم بتغطية الطوابع واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شطف الطوابع جيدا بماء DI.
قم بإزالة الماء الزائد من السطح كما هو موضح سابقا واترك الطوابع تجف مكشوفة لمدة 30 دقيقة. إذا لم تكن الأغطية المغلفة بالبروتين أو الطوابع جافة تماما بعد 30 دقيقة ، فاستخدم مسدس هواء مصفى لتجفيفها تماما. ادفع جانب النمط من الطوابع على الأغطية مع ضغط كاف لهم لإجراء اتصال كامل.
اتركه دون إزعاج لمدة 15 دقيقة. ثم قشر بعناية طوابع PDMS من الأغطية. باستخدام مجهر الفلورسنت مع المرشح المناسب ، تحقق من دقة الأغطية المنقوشة.
استخدم أغطية الغطاء المنقوشة على الفور أو قم بتخزينها بعيدا عن الضوء المباشر حتى الاستخدام مرة أخرى. قبل تحضير سلائف هيدروجيل PAA ، قم بإزالة حمض الأكريليك NHS ester من الثلاجة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتحه. قم بإعداد طبق قابل للتبديل عن طريق تعقيمه بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم احتضانه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
تحت غطاء الدخان ، أضف 1.25 ملليلتر من 40٪ من مادة الأكريلاميد المحضرة في ماء DI إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إلى نفس الأنبوب ، أضف 175 ميكرولتر من محلول ثنائي الأكريلاميد المحضر في ماء DI. ثم أضف 500 ميكرولتر من 10X PBS ، متبوعا ب 2.915 ملليلتر من ماء DI.
ماصة 969 ميكرولتر من هذا السلائف في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر وتخزين الباقي عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قياس 50 إلى 100 ملليغرام من APS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الطازج وتخفيفه إلى 100 ملليغرام لكل ملليلتر في ماء DI. افتح استر NHS في غطاء المحرك وقم بقياس ما يصل إلى ثلاثة ملليغرام من NHS بعناية في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير.
تمييع استر NHS إلى ملليغرام واحد لكل ملليلتر في 1X PBS. تحت غطاء الدخان ، أضف ميكرولترين من TEMED إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 969 ميكرولتر أليكوت من سلائف PAA. أضف 15 ميكرولتر من HCL مولاري واحد لتقليل الرقم الهيدروجيني لمحلول الهيدروجيل وتجنب التحلل المائي لإستر NHS.
أضف 10 ميكرولترات من محلول استر NHS إلى الأنبوب. نفذ الخطوات التالية في خزانة السلامة الأحيائية. ضع الغطاء الذي يبلغ قطره 30 ملم بعناية داخل الجزء الأوسط من طبق الغطاء الذي تم ضبطه مع الجانب المعالج ب 3-APTMS و glutaraldehyde لأعلى وقم بربط الحلقة البلاستيكية في الأعلى.
قم بإعداد الغطاء المزخرف مع الحد الأدنى من التعرض للضوء للتحضير للخطوة التالية. ماصة خمسة ميكرولترات من محلول APS في أنبوب أليكوت السلائف PAA ، ثم عكس ومزيج. ماصة على الفور 35 ميكرولتر من هذا الحل على غطاء 30 ملم.
ضع الغطاء المزخرف على المحلول مع جانب البروتين لأسفل. احرص على عدم إنشاء فقاعات هواء في الهيدروجيل. حماية الهيدروجيل من الضوء والسماح له بالبلمرة لمدة 90 دقيقة.
بمجرد أن يتبلمر الهيدروجيل ، استخدم شفرة حلاقة أو مشرط لإزالة الغطاء العلوي ، وتأكد من أن الغطاء لا يسقط أو ينزلق عن الجل بمجرد إزالته لتجنب تدمير النمط الموجود على سطح الجل. لتخميل أي استر NHS متبقي في الهيدروجيل ، أضف ملليلترين من PBS المعقم إلى الجل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قم بإعداد المواد الهلامية على الفور للتجارب أو تخزينها بين عشية وضحاها في PBS معقمة عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
تم نقش الهلاميات المائية بشكل غير مباشر باستخدام الفيبرونيكتين الفلوري لتصور وقياس قوى الجر الخلوية داخل المجموعات وإنشاء أنماط جزيرة ذات حجم وشكل محددين مسبقا. كانت جودة النمط مرتبطة مباشرة بدقة القالب الرئيسي الذي تم صب ختم PDMS منه. يمكن لهذه الطريقة أن تختلق أنماطا معزولة ومحددة جيدا من الجزر ذات الشكل المحدد مسبقا.
كانت نقاط التصاق الفيبرونيكتين موجودة فقط داخل المنطقة المطلوبة من الجزيرة. سمحت هذه الجزر المعزولة من نقاط الالتصاق بتحكم أفضل في شكل العنقود. يعد طلاء طوابع PDMS باثنين من 3-APTMS الصغيرة أمرا بالغ الأهمية لأنه سيحد من فعالية طريقة الإزالة ، في حين أن الكثير سيخلق بقايا برتقالية على سطح الطوابع.
يمكن استخدام الأنماط التي تم إنشاؤها هنا لتحديد قوى الجر الخلوية في كل من الخلايا الفردية والمجموعات ، مما يعطي نظرة ثاقبة على قدرتها على الحفاظ على التوازن الميكانيكي.
