يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا حاسما في الأمراض البشرية. العلماء يجدون تطبيقا لا نهاية له في الأدوية. يوضح هذا البروتوكول تطبيق تقنية الرحلان الكهربائي لدرجة الحرارة المحمولة كنهج غير تسلسلي لتحديد سريع وموثوق به لتعديل الحمض النووي الريبي في تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.
تم استخدام النهج القائم على الرحلان الكهربائي tTG الصغير لتوصيف الاختلافات بين ملف تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والشظايا المقابلة غير المحررة. تم استخدام درجات تشابه النمط لتقييم قابلية تكرار الطريقة. تمكن هذه المنصة من اكتشاف حتى الاستبدال القائم على أساس واحد في الحمض النووي الريبي ، بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة.
ومن المتوقع أن تساعد هذه الأداة التحليلية في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية Begin من خلال تحديد شظايا الجينات مع ملامح ذوبان مختلفة وتوليد منحنيات الانصهار المتوقعة باستخدام أداة Umelt HETS المستندة إلى الويب. صمم ثلاثة أزواج من 300 إلى 324 شظايا جينية للزوج الأساسي لكل جين مستهدف. حدد الزوج غير المحرر أو المحرر الذي يوضح الفرق الأقصى بين مناطق الانصهار على محور الهيلية لمزيد من التحليل.
لتحليل micro-TGGE ، قم بتوليف الجزء الجيني المحدد عن طريق تضخيم PCR. صمم الاشعال الأمامي والخلفي باستخدام برنامج دينامو الحمض النووي، وتحقق من تسلسل التمهيدي باستخدام أداة NCBI Primer-BLAST. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مصدر الجينات المحررة وغير المحررة باستخدام الطرق القياسية.
توليف cDNA المقابل ، وإعداد 20 ميكرولتر من خليط تفاعل PCR ، وإعداد PCR كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم ، امزج ستة ميكرولترات من منتج PCR مع ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل هلام 6x في أنبوب سعة 250 ميكرولتر ، وشكل الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر بالماء المعقم. قم بتخزين منتج PCR عند 25 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
لتجميع أشرطة الجل ، قم بشطيرة لوحة الجل العلوية بين اللوحتين الأخريين في حامل كاسيت الجل لبلمرة الهلام. لتحضير جل بولي أكريلاميد ، أضف 7.2 جرام من اليوريا إلى أنبوب 50 ملليلتر وتذوب في 10 ملليلتر من الماء المعقم. سخني العينة في الميكروويف لمدة 20 إلى 30 ثانية.
واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أضف ثلاثة ملليلترات من 5x TBE buffer ، و 2.25 ملليلتر من مكرر الأكريلاميد ، و 75 ميكرولتر من 10x بيرسلفات الأمونيوم ، و 15 ميكرولتر من TEMED إلى المحلول. صب محلول الجل في حامل كاسيت الجل ببطء بزاوية مائلة لتجنب فقاعات الهواء.
بعد حوالي 30 دقيقة ، قم بتفكيك أشرطة الجل وتنظيفها. استخدم جهاز micro-TGGE مع مجموعة تدرج درجة الحرارة عموديا على اتجاه هجرة الحمض النووي. انقع منصات العازلة للرحلان الكهربائي العلوية والسفلية في ملليلترين من المخزن المؤقت 1x TBE.
ضع كاسيت الجل في وحدة غرفة الرحلان الكهربائي الأفقي ، وضع منصات التخزين المؤقت العلوية والسفلية. ثم قم بتحميل 10 ميكرولترات من منتج PCR في البئر الأوسط ، وميكرولتر واحد من منتج PCR في كل جانب جيدا. انتظر لمدة دقيقة ، وقم بتوصيل وحدة الطاقة وقم بتزويد 100 فولت لمدة 12 دقيقة عند تدرج درجة حرارة خطي من 15 إلى 65 درجة مئوية.
بعد اكتمال التشغيل. أخرج الكاسيت وأزل الغطاء الزجاجي العلوي. صب 300 ميكرولتر من 10x صبغة SYBR Gold على الجل.
تصور ملامح الذوبان باستخدام مصباح LED الأزرق المثبت في الجهاز الكهربائي بحجم راحة اليد. كرر كل تجربة كهروبلوريتية ثلاث مرات لتأكيد قابلية البيانات للتكرار. قم بتنزيل برنامج محلل micro-TGGE وفتحه.
افتح ملف JPEG الذي يحتوي على صورة الجل. انقر فوق الزر "الإطار" وحدد الإطار المناسب لصورة الهلام. انقر على زر تصحيح الإحداثيات "وأضف نقطتين مرجعيتين.
انقر على إضافة نقاط الميزة"زر وإضافة نقاط عينة. ثم احفظ بيانات صورة الجل المعالجة بتنسيق micro-TGGE. انقر على زر العينة وحدد خيار البحث عن نقاط بسيطة لمقارنة صورتين أو أكثر.
بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي C-to-U، أظهرت العينة غير المحررة مع cBase الأصلي نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط من العينة المحررة باستخدام قاعدة U المعدلة. بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي من A إلى I، عرضت العينة التي تم تحريرها باستخدام قاعدة G المعدلة نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط مقارنة بالعينة غير المحررة باستخدام القاعدة A الأصلية. بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي العكسي من U-to-C ، أظهرت العينة المعدلة في الجين الأول مع قاعدة C المعدلة نمط انصهار أطول بين نقطتي الانصهار الأولية والنهائية للخيط مقارنة بالعينة غير المحررة مع قاعدة U الأصلية.
ومع ذلك ، لم يلاحظ نمط مماثل للجين الآخر. كانت درجات تشابه النمط لأنواع تحرير الحمض النووي الريبي من C-to-You و A-to-I أقل من تلك الموجودة في نوعي تحرير الحمض النووي الريبي U-to-C. من المحتمل أن يكون هذا الاختلاف مرتبطا بالمواقع المعنية لمواقع التحرير.
أظهر تحليل uMelt HETS أن تعديل C-to-U سيحول منحنى الانصهار إلى اليسار على طول محور درجة الحرارة. كانت درجات تشابه النمط المحسوبة من تحليلات micro-TGGE للأجزاء غير المحررة والأجزاء الثلاثة المحررة متسقة مع النتائج المتوقعة باستخدام uMelt. يعد تحسين جزء الجين المستهدف أمرا بالغ الأهمية للتمييز الواضح بين السبب المحرر وغير المحرر.
وقد تم تبسيط هذه العملية في البروتوكول الحالي.
