يتيح هذا النهج الموجه بالنسب التحليل البروتيني للأحداث التنموية المهمة بدقة مكانية وزمانية داخل جنين الفقاريات الذي ينقل معلومات لا يمكن الوصول إليها من خلال قياسات الجنين الكاملة. يمكن توسيع هذا النهج بسهولة لدراسة البروتينات والمستقلبات والنسخ من الخلايا الجنينية المختلفة أثناء تمايزها أثناء التطور. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للآليات الجزيئية التي تتحكم في التطور الطبيعي والمرض ، بما في ذلك آليات تحريض الأنسجة والالتزام بمصير الخلية أثناء التطور المبكر.
استخدم حلقة شعر لتوجيه كل جنين إلى بئر ووضعه برفق بحيث تكون الخلية المستهدفة موضع الاهتمام في الزاوية اليمنى للإبرة الدقيقة. اتبع خرائط مصير الأنسجة xenopus laevis لتحديد خلية السلائف من سلالة الاهتمام. استخدم ملقطين شحذين لإزالة غشاء فيتيلين المحيط بالجنين برفق.
عزل الخلايا المفردة عن الجنين عن طريق التشريح اليدوي باستخدام الملقط. ابدأ بإعداد إبرة الحقن التي تحتوي على محلول تتبع النسب. قم بتركيب إبرة الحقن المجهري في حامل ماصة دقيق يتم التحكم فيه بواسطة مناور دقيق متعدد المحاور.
قم بتوصيل حامل الماصة الصغير بحاقن دقيق واملأ الإبرة بمقتفي النسب عن طريق الضغط السلبي. قم بمعايرة الإبرة وضبط حجم طرف الإبرة ووقت الحقن لتقديم ما يقرب من نانولتر واحد من محلول تتبع النسب المقاس بالزيت المعدني. تأكد من أن حجم القطرة التي يتم حقنها دقيق واضبط إعدادات الحاقن إذا لزم الأمر.
اغمر طبق الطين بالحقن الدقيق بمحلول 3٪ fCAL وانقل ما يقرب من 10 أجنة إلى طبق الطين باستخدام ماصة نقل. حقن الخلايا ذات الأهمية مع ما يقرب من نانولتر واحد من ديكستران الفلورسنت أو 200 بيكوغرام من GFP mRNA. باستخدام مجهر ستيريو ، تأكد من نجاح وضع العلامات على الخلايا.
تأكد من حقن الخلية المقصودة فقط. تجاهل الأجنة التي تحتوي على خلايا مصابة أو مصنفة بشكل غير صحيح وفقا للسياسات المؤسسية. نقل الأجنة المحقونة إلى طبق بتري يحتوي على 0.5x محلول شتاينبرغ.
استزراعهم بين 14 إلى 25 درجة مئوية حتى يصلوا إلى مرحلة النمو المطلوبة. نقل ثلاثة إلى خمسة أجنة إلى طبق أجار يحتوي على 0.2x محلول شتاينبرغ للتشريح الدقيق. استخدم ملقط لتشريح الاستنساخ المسمى من الجنين.
اجمع الأنسجة المشرحة باستخدام ماصة من 0.5 إلى 10 ميكرولتر وقم بإيداعها في ملف طرد مركزي صغير. باستخدام ماصة ، قم بشفط الوسائط المحيطة بالأنسجة المجمعة للحد من الأملاح في العينة لتجنب التداخل مع تحليل HRMS. قم بتجميد الخلايا المعزولة على الفور عن طريق وضع قارورة العينة على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل.
قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل قياس الطيف الكتلي. لمعالجة عينة الخلية الواحدة بواسطة CE ، قم بتشويه البروتينات عن طريق تسخين العينة إلى 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا. ثم قم بموازنة العينة مع درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وأضف التربسين إلى العينات للهضم.
للتحليل بواسطة NanoLC ، قم بتحليل ما يصل إلى خمسة أنسجة تشريح في 50 ميكرولتر من محلول التحلل. قم بتسهيل العملية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. لمعالجة الأنسجة المشرحة ، احتضان المحللة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم حبيبات حطام الخلية والصفائح الدموية صفار البيض عند أربع درجات مئوية عن طريق التمركز عند 4،500 RCF. انقل المادة الطافية إلى قارورة طرد مركزي صغيرة نظيفة وأضف 10٪ SDS للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ SDS في المحلل. بالنسبة للأنسجة، أضف 0.5 مولار ديثيوثريتول إلى المحللة للحصول على تركيز نهائي يبلغ حوالي 25 ملي مولار.
ثم احتضان المحللة لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية لتقليل روابط ثاني كبريتيد البروتينات كيميائيا. أضف 0.5 مولار يودواسيتاميد للحصول على التركيز النهائي لحوالي 75 مليمولار في المحللة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف 0.5 مولار ثنائي ثيوثريتول نفس الحجم الأولي لإخماد المتفاعلات المتبقية من تفاعل الألكلة.
ترسب البروتينات في الأسيتون بين عشية وضحاها كما هو موضح في بروتوكول النص وإعادة تكوينها في 0.5 مولار بيكربونات الأمونيوم. أضف التربسين لهضم العينة واحتضان القوارير عند 37 درجة مئوية. لفصل الببتيدات باستخدام CE ، أعد تكوين البروتين المهضوم في واحد إلى اثنين ميكرولتر من مذيب العينة.
دوامة العينة المختلطة والصهر المركزي عند 10،000 RCF لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية لحطام خلايا الحبيبات. قم بتهيئة أداة CE-ESI عن طريق شطف الشعيرات الدموية CE باستخدام BGE. ضع ميكرولترا واحدا من العينة في قارورة العينة وحقن واحد إلى 10 نانولتر من العينة في الشعيرات الدموية لفصل CE عن طريق الحقن الهيدروديناميكي.
انقل نهاية مدخل الشعيرات الدموية لفصل CE إلى BGE. ابدأ الفصل الكهربائي عن طريق زيادة جهد فصل CE تدريجيا من الأرض الأرضية. تضمن الجهود من 20 إلى 28 كيلوفولت مع تيار أقل من 10 ميكرو أمبير أداء فعالا مستقرا وقابلا للتكرار للتحليل.
للفصل باستخدام Nano LC ، أعد تعليق عينة الببتيد في المرحلة المتنقلة A.يعتمد تركيز العينة وحجم الحقن على نظام LC والعمود المتاحين. انقل العينة إلى قارورة LC. قم بتحميل ما يقرب من 200 نانوجرام إلى ميكروغرام من عينة الببتيد في العمود التحليلي C18 وافصل الببتيدات بمعدل تدفق 300 نانولتر في الدقيقة باستخدام شطف التدرج كما هو موضح في مخطوطة النص.
باستخدام الكاميرا ، تحقق من تدفق السائل عبر باعث الرش الكهربائي وافحص الإعداد بصريا بحثا عن التسريبات المحتملة. اكتساب أحداث قياس الطيف الكتلي وتسلسل الببتيدات كما هو موضح في مخطوطة النص. تم الكشف عن اختلافات الترجمة الجينية بين خلايا D11 التي تم تشريحها من أجنة مختلفة باستخدام CE-ESI-HRMS.
تم تحليل استنساخ الخلايا التشريحية المسمى بالنسب بواسطة LC-HRMS. أظهر تحليل مسار البروتينات ترجمة البروتين غير المنظمة واستقلاب الطاقة في منظم سبيمان مع الأديم الظاهر العصبي. تم إثراء بروديوم الأديم الظاهر العصبي بالبروتينات المرتبطة بالنقل النووي لشحنة البروتين في الخلية التي تشير على الأرجح إلى أحداث المصب بعد الإشارات.
أشار تحليل التخصيب للوظائف الجزيئية إلى التنظيم في بدء الترجمة ، وربط الحمض النووي الريبي وربط مركب البروتيازوم مما يشير إلى دور دوران البروتين الديناميكي في تطوير منظم سبيمان. حدد الأجنة النمطية فقط لهذا البروتوكول لتحسين قابلية التكاثر وتفسير النتائج. يجب نقل الأنسجة المقطعة إلى قنينة وتجميدها على الفور تحتوي على أقل قدر ممكن من المخزن المؤقت للوسائط لتقليل التلوث من الأملاح العازلة.
وقد مكننا هذا النهج من دراسة ديناميكيات البروتين في الخلايا المحددة وسلالات الخلايا في الأجنة الحية. مكنتنا المعلومات الجديدة التي حصلنا عليها حول الإنتاج الزماني المكاني للبروتينات المهمة في الأنسجة النامية من تصميم تجارب مستهدفة لتقييم وظيفتها البيولوجية.
