يعد تفسير بيانات التسلسل الناتجة عن تجربة تنميط الريبوسوم أمرا بالغ الأهمية لقياس الأنشطة الانتقالية للريبوسومات على الحمض النووي الريبوزي المرسال كميا ، ولدراسة آليات التنظيم الانتقالي. في هذا البروتوكول ، سنصف الإجراء الحسابي لاستخدام بيانات التنميط الريبوسومي و RiboCode ، وهي أداة سطر أوامر لفك تشفير ترجمة mRNA على نطاق واسع من الجينوم ودقة نيوكليوتيدات واحدة. تسمح هذه الطريقة بالبحث عن الببتيدات الجديدة الناشئة عن المناطق الجينومية خارج جينات ترميز البروتين المشروحة ، وتوفر فرصة لتحديد معدل ترجمة mRNA.
للبدء، افتح نافذة محطة لينكس، وقم بإنشاء بيئة conda عن طريق تنفيذ الأمر. قم بالتبديل إلى البيئة التي تم إنشاؤها، وقم بتثبيت RiboCode والتبعيات عن طريق تنفيذ الأمر. للحصول على ملفات مرجع الجينوم للتسلسل المرجعي، انتقل إلى موقع Ensembl على الويب، ثم انقر على تنزيل، متبوعا بتنزيل FTP.
انقر فوق الخيار FASTA في العمود DNA FASTA ، وحدد الصف الذي تكون فيه الأنواع بشرية ، كما هو موضح في الجدول على صفحة موقع الويب. في صفحة موقع Ensembl على الويب ، انسخ الرابط كما هو مذكور في النص ، ثم قم بتنزيل الملفات الموجودة في المحطة الطرفية وفك ضغطها عن طريق تنفيذ الأمر. للحصول على تعليق توضيحي مرجعي، انقر بزر الماوس الأيمن فوق GTF في مجموعات جينات العمود في آخر صفحة ويب مفتوحة.
انسخ الرابط وقم بتنزيله باستخدام الأمر. للحصول على تسلسلات rRNA، افتح متصفح جينوم UCSC، ثم انقر على أدوات، وحدد متصفح الجدول في القائمة المنسدلة. في صفحة متصفح الجينوم UCSC ، حدد الثدييات للطبقة ، والإنسان للجينوم ، وجميع الجداول للمجموعة ، وقناع R للجدول ، والجينوم للمنطقة.
بالنسبة إلى عامل التصفية، انقر فوق إنشاء للانتقال إلى صفحة جديدة، وقم بتعيين فئة المندوب كما تتطابق مع rRNA. انقر فوق إرسال، ثم قم بتعيين تنسيق الإخراج إلى تسلسل، واسم ملف الإخراج كما HG38_rRNA. FA. أخيرا ، انقر فوق الحصول على الإخراج ، ثم حدد الحصول على تسلسل لاسترداد تسلسل rRNA.
للحصول على مجموعات بيانات التنميط الريبوسومي من أرشيف قراءة التسلسل، قم بتنزيل عينات النسخ المتماثل لمجموعة المعالجة si-eIFe، وأعد تسميتها عن طريق تنفيذ الأمر. ثم قم بتنزيل عينات النسخ المتماثل لمجموعة التحكم، وأعد تسميتها عن طريق تنفيذ الأمر. لإزالة تلوث rRNA، ابدأ فهرسة تسلسلات مرجع rRNA عن طريق تنفيذ الأمر.
بعد الفهرسة، قم بمحاذاة القراءات إلى مرجع rRNA لاستبعاد القراءات الناشئة من rRNA عن طريق تنفيذ الأمر. ابدأ بإنشاء فهرس جينوم عن طريق تنفيذ الأمر. ثم قم بمحاذاة القراءات النظيفة بدون تلوث rRNA إلى المرجع الذي تم إنشاؤه عن طريق تنفيذ الأمر ، ثم فرز ملفات المحاذاة وفهرستها عن طريق تنفيذ الأمر.
قم بإعداد التعليقات التوضيحية للنص عن طريق تنفيذ الأمر. حدد شظايا الريبوسوم المحمية بأطوال محددة، وحدد مواضعها في موقع P عن طريق تنفيذ الأمر. قم بتحرير ملفات التكوين لكل نموذج ودمجها.
ثم قم بتشغيل RiboCode عن طريق تنفيذ الأمر. أظهر التوزيع الترددي لأطوال القراءات أن معظم شظايا الريبوسوم المحمية تتوافق مع 25 إلى 35 نيوكليوتيدات. تم تحديد مواقع موقع P لأطوال مختلفة من الشظايا المحمية بالريبوسوم من خلال فحص المسافات من نهاياتها الرئيسية الخمسة إلى كودونات البداية والتوقف المشروحة.
تظهر نتائج رسم الخرائط أن 10،394 جينا يشفر لإطارات القراءة المفتوحة المشروحة. علاوة على ذلك ، يقوم 509 و 168 جينا بالترميز لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع والمصب ، في حين أن 939 جينا يشفرون إما لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع أو المصب ، متداخلة مع إطارات القراءة المفتوحة المشروحة المعروفة. علاوة على ذلك ، يتم تشفير 68 جينا لترميز البروتين و 2،601 جينا غير مشفر لإطارات القراءة المفتوحة الجديدة.
أظهر توزيع الطول أن إطارات القراءة المفتوحة في المنبع والمصب والرواية والمتداخلة كانت أقصر من إطارات القراءة المفتوحة المشروحة. تم حساب عدد الأجزاء المحمية نسبيا من الريبوسوم لكل إطار قراءة مفتوح، مما كشف عن أن كثافات الريبوسوم لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع كانت أعلى بكثير في الخلايا الناقصة eIF3e منها في الخلايا الضابطة. كشف تحليل الميتاجين أن كتلة من الريبوسومات توقفت بين الكودون 25 و 75 في اتجاه مجرى الكودون البادئ، مما يشير إلى أن استطالة الترجمة قد يتم حظرها في وقت مبكر في الخلايا الناقصة eIF3e.
تم فحص ملامح كثافة مواقع P لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع ل PSMA6 وإطارات القراءة المفتوحة في المصب للجين SENP3-EIF4A1 ، مما يدل على أنماط دورية وكثافات شظايا الريبوسوم المحمية. يعد التحقق من مواقع القراءات حول كودونات البداية والتوقف لمناطق ترميز البروتين المعروفة ضروريا لتقييم الخصائص الدورية للقراءات لكل طول. RiboCode، جنبا إلى جنب مع أداة سطر الأوامر الأخرى، RiboMiner يمكن أيضا إجراء مراقبة الجودة والتحليلات المتعددة مثل تحديد وتصور انشغال الريبوسومات على إطارات القراءة المفتوحة المتوقعة.
توفر هذه الأداة الحسابية طريقة عالية الإنتاجية لتحديد أحداث الترجمة غير القانونية باستخدام بيانات التنميط الريبوسومي في سياقات فسيولوجية محددة، وكيفية تعديل الترجمة استجابة للحافز.
