يساعد بروتوكولنا الجديد على تمييز وتحديد ثلاث حالات من حلقات الأنبوب ، مثل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والأنابيب الحرة في الأنسجة الحيوانية. تتكون هذه التقنية من خطوات بسيطة ويمكنها تقييم الاستقرار الهيكلي للأنابيب ، والذي لا يمكن اكتشافه عن طريق القياس الكمي للأنابيب بعد التعديل المتعدي. هذه الطريقة ضرورية للبحث وتطوير طرق علاجية للأمراض التي يكون فيها استقرار الأنابيب الدقيقة أمرا بالغ الأهمية ، مثل مرض الزهايمر والسرطانات.
ابدأ الإجراء عن طريق تحضير ملابس المختبر لتشريح الأنسجة. املأ صندوقا بالثلج المجروش وضع طبقين بتري عليه. املأ طبقا واحدا بمحلول عازل فوسفات بارد مثلج أو PBS للغسيل العابر وتخزين الأنسجة المشرحة.
ضع ورق الترشيح المبلل ب PBS على الطبق الثاني. بعد ذلك ، قم بوزن الأنابيب الدقيقة التي يبلغ سعتها 1.5 ملليلتر المملوءة ب PBS لتخزين الأنسجة المشرحة. بعد استخراج الأنسجة من فأر القتل الرحيم ، انقلها إلى الأنابيب وأعد وزن كل أنبوب دقيق.
انقل الأنسجة إلى خالط زجاجي باستخدام محلول تثبيت الأنابيب الدقيقة الباردة أو MSB + وسط ، وقم بتجانس الأنسجة على الفور باستخدام خالط مبرد. الآن نقل تجانس الأنسجة إلى أنبوب دقيق 2 مليلتر باستخدام ماصة باستور وأجهزة الطرد المركزي في 2،400 غرام لمدة ثلاث دقائق عند درجتين مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر لإزالة الحطام.
دوامة الطافية أو جزء S1 في أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ماصة على الفور 200 ميكرولتر من جزء S1 في أنبوب ميكرو الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 100،000 غرام باستخدام الدوار TLA-55 لمدة 20 دقيقة عند درجتين مئوية. بعد الطرد المركزي الثاني ، افصل طاف S2 عن راسب P2.
قم على الفور بنقل الكمية الكاملة من جزء S2 إلى أنبوب دقيق للطرد المركزي واستخدم دوار TLA-120.2 لتدويره عند 500،000 جم لمدة 60 دقيقة عند درجتين مئويتين. بعد الطرد المركزي الثالث ، افصل طاف S3 عن راسب P3. قم بإذابة جزء S3 بالكامل في 200 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم 2X ، أو المخزن المؤقت لعينة SDS.
امزج كسور S1 المتبقية بحجم متساو من المخزن المؤقت لعينة 2X SDS لاستخدامها كمنحنى قياسي للنشاف الغربي. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS إلى أنابيب الكسر P2 و P3. بعد ذلك ، قم بصوتنة المحلول لفترة وجيزة لإذابة الراسب قبل نقل العينات إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر ووضعها في صندوق الثلج.
غلي جميع العينات عند 100 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. شكلت الأنابيب الدقيقة في جزء P2 34.86٪ من إجمالي ألفا توبولين في دماغ الفأر ، في حين شكلت تلك الموجودة في الكسور P3 و S3 56.13٪ و 9.01٪ على التوالي. لم تكن النسبة المئوية لتوبولين بيتا 3 في كسور P2 و P3 و S3 مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في ألفا توبولين.
أظهر الجزء S2 مرورا محدودا للتوبولين عبر عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون ، بينما سمح جزء S3 بمرور كامل لمجمعات التوبولين. أدى الفصل الكروماتوغرافي إلى شطف 100 كيلو دالتون من توبولين S3. تم استرداد نسب متساوية من ألفا وبيتا توبولين في كل جزء.
تم إثراء كسور P2 بشكل كبير مع ألفا توبولين الأسيتيل ، بينما كان التيروزين ألفا توبولين سائدا في جزء P3. أدى تجميد الدماغ قبل التجانس إلى انخفاض تركيز ألفا توبولين في أجزاء P2. ومع ذلك ، زاد ألفا توبولين في جزء P3.
كما قلل التجميد من مستويات الأستيل وزاد من مستويات التيروزين لألفا توبولين في جزء P2. انخفض علاج نوكودازول ألفا توبولين في جزء P2. على عكس التجميد ، لم يؤثر نوكودازول على تعديلات توبولين P2 بعد الترجمة.
أظهرت أنسجة المخ تركيزا أعلى بكثير من الأنابيب P2 ، بينما تركزت توبولين P3 في الأنسجة التكاثرية. أظهر النشاف الغربي أن توبولين P2 الموجود على وجه التحديد في الجهاز العصبي نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة ، وأن توبولين P3 نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة. استقرار الأنابيب الدقيقة ديناميكي للغاية.
من المهم إكمال هذا البروتوكول بسرعة ، دون انقطاع ، في بيئة درجة الحرارة الباردة. تأكد أيضا من عدم تجميد الأنسجة والكسور حتى يتم إذابتها في المخزن المؤقت لعينة SDS. من المتوقع أن يؤدي الجمع بين العرض المناعي باستخدام كل جزء مع البروتينات إلى تحديد العوامل المشاركة في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.
باستخدام هذه الطريقة ، كشفنا عن مدى وجود تاو الطبيعي على الأنابيب الدقيقة. يمكن استخدامه أيضا لدراسة كيف يصبح غير طبيعي في أدمغة المسنين من أجل تحديد أهداف دوائية جديدة للخرف.
