qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى

ينتج بروتوكول الهلام تفاعلات qPCR جاهزة للاستخدام تقلل من الوقت والخطوات المطلوبة لبدء التشغيل. يسمح هذا البروتوكول بإنتاج تفاعلات qPCR والتحكم فيها من أجل الجودة والكميات الكبيرة في وقت واحد ، مما يقلل من فرص خطأ المشغل أثناء حسابات الوصفة أو الاقتباس في الآبار. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي qPCR تم تحسينه بالكامل بالفعل بالتنسيق المجمد التقليدي.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مهما لأن خطوتين من خطوات مراقبة الجودة الرئيسية مرئية. لتحضير محلول ميليزيتوز ، قم بوزن أربعة جرامات من ميليزيتوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر ، وأضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة حتى يذوب المسحوق. اجعل الحجم النهائي يصل إلى 10 ملليلتر بماء خال من النيوكلياز ، ثم قم بتسمية المحلول وتخزينه عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.

لتحضير محلول تريهالوز ، قم بوزن أربعة جرامات من التريهالوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر ، أضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ودوامة بأقصى سرعة حتى يذوب المسحوق. ثم قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر بالماء الخالي من النيوكلياز وتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قم بتسمية المحلول وتخزينه عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.

لتحضير محلول الجليكوجين ، قم بوزن جرامين من الجليكوجين في أنبوب سعة 15 ملليلترا ، وأضف ستة ملليلترات من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة حتى يذوب المسحوق. احتفظ بالمحلول عند درجتين إلى ثماني درجات سلزية لمدة ثماني إلى 12 ساعة لأن إذابة الجليكوجين تنتج الكثير من الفقاعات. في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول من الحضانة ، وقم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر بالماء الخالي من النيوكلياز وتخزين المحلول المسمى عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.

لتحضير محلول اللايسين ، قم بوزن 7.5 ملليغرام من اللايسين في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، وأضف ستة ملليلتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة حتى يذوب المسحوق. تشكل حجم إلى 10 ملليلتر مع الماء خالية من النيوكلياز. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرون وخزنه في درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.

لتحضير خليط الهلام ، امزج الأحجام المناسبة من محاليل المخزون في أنبوب بلاستيكي سعة 50 ملليلتر. امزج الكواشف عن طريق قلب الأنبوب 10 مرات وتخزين المحلول المسمى عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. لتحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام ، قم بإذابة الكواشف في حاوية مبردة.

ثم امزج كميات مناسبة من الكواشف في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لإعداد مزيج رئيسي كاف لشريط ثمانية أنابيب أو لوحة بئر 96. ماصة التالية 18.5 ميكرولتر من مزيج الهلام الرئيسي على كل بئر تفاعل ووضع الأنابيب أو اللوحة في دعامة موصلة للحرارة داخل فرن التفريغ. في حالة استخدام 96 طبقا جيدا ، ضع كيسا واحدا من طين البنتونيت في الفرن لكل طبقين 96 بئرا لامتصاص الماء.

عند اكتمال الدورة ، افحص الأنابيب أو الألواح بحثا عن الهلام المناسب للكواشف من خلال التأكد من تقليل الحجم بشكل واضح إلى حوالي خمسة ميكرولتر وأن السوائل لا تتحرك عند النقر على الأنابيب أو الألواح بالأصابع. أغلق الأنابيب أو الألواح وقم بتخزينها عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة ثماني إلى 12 ساعة قبل الاستخدام. لاستخدام qPCR الهلامي ، قم بإزالة شريط الأنبوب أو اللوحة من الثلاجة وافتحه في محطة عمل لمعالجة العينات.

أضف 15 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز وخمسة ميكرولترات من عينة الحمض النووي (DNA) إلى كل وعاء تفاعل. أغلق الأنابيب أو الألواح ، وقم بإجراء التجربة المطلوبة ، وقم بإجراء تحليل منتظم للبيانات. في البروتوكول الحالي ، تظل درجة الحرارة داخل الغرفة ثابتة عند 30 درجة مئوية ، بينما يتراوح الضغط بين 910 إلى 930 مليبار وشبه فراغ.

بعد دورة التفريغ ، يتناقص حجم المزيج الرئيسي داخل الأنبوب ، ويصبح هلاميا في الأسفل ولا يتناثر على الجدران عند النقر على الأنابيب. إذا كان الهلام غير مكتمل ، يتناثر السائل على جدران الأنبوب عند النقر على الأنابيب. يظهر هنا الكشف عن الحمض النووي للمثقبية الكروزية باستخدام تسلسلات قليلة النوكليوتيد المنشورة.

أدى اكتشاف نفس العينة عندما لم يتم تنفيذ الهلام بشكل صحيح إلى فقدان الحساسية. الخطوة الأكثر أهمية هي حساب حجم الكواشف قبل الهلام. يجب أن يتذكر المشغل عدم إضافة الماء ، حيث سيتم إزالته أثناء العملية.

إذا تم اتباع خطوات البروتوكول عن كثب ، فلن يواجه المشغلون ذوو المهارات المختبرية والبيولوجيا الجزيئية الأساسية صعوبة في أداء عملية الهلام.