هذا البروتوكول هو الأول من نوعه لتطبيق photostatins على جنين الفأر الحي قبل الزرع ، والنظر في الاستخدامات لاستخدام الأدوية القابلة للتحويل الضوء على الأنظمة الفسيولوجية 3D الأخرى. تسمح الفوتوستانات القابلة للتحويل الضوئي بالتلاعب بنمو الأنابيب الدقيقة ، في المكان والزمان ، وتحويلها مرة أخرى إلى حالة إيقاف التشغيل. يمكن أن يؤدي تعريض الفوتوستاتينات عن غير قصد للضوء الأزرق ، قبل التجربة ، إلى تنشيطها قبل الأوان.
لذلك ننصح بالعمل في ظلام دامس ، أو ظروف الضوء الأحمر ، في جميع الأوقات عند إعداد عيناتك. في الظروف المظلمة الصارمة ، باستخدام الضوء الأحمر فقط للإضاءة ، ابدأ في صنع المخزون وحل العمل الوسيط ل PST-1P في الماء فائق النقاء. كما هو موضح في نص المخطوطة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف PST-1P في KSOM الطازج لتحقيق التركيز النهائي البالغ 40 M.To قم بإعداد شريحة الغرفة للتصوير الحي ، وأضف 10 لتر من KSOM المعالج ب PST-1P في وسط بئر واحد ، لتشكيل قطرة نصف كروية. لمنع القطيرة من التبخر ، قم بتغطيتها بزيت معدني كاف. بعد ذلك ، قم بلف طبق الثقافة المحضر بشكل فضفاض في رقائق معدنية ، أو ضع طبق الثقافة في حاوية غير شفافة محكمة الإغلاق في الحاضنة لضمان عدم التعرض للضوء.
بعد نقل الأجنة إلى قطرة KSOM المعالجة ب PST-1P ، تأكد من تجميع الأجنة في وسط القطرة ، وتسويتها في قاع الطبق. بمجرد إعداد عدسة هدف الغمر ، قم بتركيب شريحة الغرفة على المجهر ، داخل غرفة بيئية. اضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وفي ظلام دامس ، لضمان أن جميع PST-1Ps في التكوين غير النشط ، وأن الأجنة يمكن أن تغرق في قاع الطبق.
استخدم شعلة الضوء الأحمر لوضع العدسة الموضوعية في ملامسة وسط الغمر. ثم حدد موقع حافة قطرة الوسط ووضع الهدف فوقه مباشرة. باستخدام وضع المسح الحي ، وليزر 561 نانومتر ، حدد موقع الأجنة داخل القطرة.
استخدم وحدات التحكم في المرحلة ووضع المسح الضوئي المباشر لتعيين نقطتي البداية والنهاية للحصول على مكدس z للجنين بأكمله. اضبط إعدادات طاقة الليزر بحد أقصى 5٪ وفقا لإشارتك. واضبط الإزاحة الرقمية على 0.900 كحد أقصى ، وفقا لإشارتك ، لتحسين مظهر مذنبات EB3-dTomato.
تقليل ضوضاء الخلفية. اضبط الثقب على ارتفاع 2 متر. دقة بكسل عند 512 × 512.
ووقت سكن البكسل عند 3.15 ثانية. واضبط التكبير/التصغير على 2x. الحصول على كومة z من الجنين كله مع فترات مقطع 1 م لتقييم مناطق نمو الأنابيب الدقيقة في الكائن الحي بأكمله.
بالنسبة لتجارب تتبع مذنب EB3-dTomato ، افتح صورة 3D z-stack ، وقم بزيادة التكبير إلى ثلاث مرات. ورسم عائد استثمار مستطيل حول منطقة الاهتمام دون الخلوية المحددة. بعد ذلك ، احصل على فيلم الفاصل الزمني لمستوى z واحد ، باستخدام المعلمات المحددة ، مع الفاصل الزمني البالغ 500 مللي ثانية.
لتنشيط PST-1P ، قم بالتبديل إلى ليزر 405 نانومتر ، واحصل على فاصل زمني آخر ، مع ضبط الليزر على 10٪ من الطاقة ، وفتح الثقب إلى أقصى حد ، ودقة بكسل 512 × 512 ، ووقت سكن البكسل 3.15 ثانية ، والتكبير ثلاث مرات ، في فاصل زمني قدره 500 مللي ثانية ، وتعيين 20 إطارا ليتم الحصول عليها. مباشرة بعد التنشيط ، قم بالتبديل مرة أخرى إلى ليزر 561 نانومتر ، وكرر الاستحواذ ، كما هو موضح سابقا ، لتأكيد فقدان مذنبات EB3-dTomato بعد تنشيط PST-1P. الآن ، لعكس PST-1P مرة أخرى إلى حالته العابرة غير النشطة ، قم بتشغيل ليزر 514 نانومتر ، واحصل على فاصل زمني آخر مع معلمات محددة.
لتصور استعادة مذنبات EB3-dTomato ، عد إلى ليزر 561 نانومتر ، وكرر الاستحواذ. في أجنة التحكم غير المعالجة ، قبل الإضاءة باستخدام ليزر 405 نانومتر ، كانت إشارة EB3-dTomato عالية داخل السيتوبلازم بأكمله للخلية ، باستثناء المنطقة النووية. بعد الإضاءة ، لم يتم الكشف عن التغييرات في الإشارة.
مشيرا إلى أن ليزر 405 نانومتر لم يسبب تلفا للصورة للجنين أو ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. أثناء معالجة PST-1P للأجنة المكونة من 16 خلية ، في ظل ظروف مظلمة صارمة ، تم الكشف عن تعبير EB3-dTomato القوي في الصورة ثلاثية الأبعاد ، مما يدل على أن PST-1P غير النشط لم يثير تثبيط بلمرة الأنابيب الدقيقة في ظل الظروف المظلمة. قبل تنشيط PST-1P ، أكد التصوير بالفاصل الزمني لمستوى z واحد تعبيرا قويا عن EB3-dTomato ، وبلمرة الأنابيب الدقيقة في منطقة دون الخلايا.
بعد تنشيط الضوء 405 نانومتر ، في غضون ثوان ، تم الكشف عن انخفاض في إشارة المذنب EB3-dTomato. وتم تحقيق استعادة الإشارة عند تعطيل PST-1P ، باستخدام ليزر 514 نانومتر. أظهرت الأجنة التي تم حقنها بالطماطم EB3-dTomato، واحتضانها باستخدام PST-1P، إمكانات جنينية طبيعية، وتطورت إلى مرحلة الكيسة الأريمية.
وديناميكيات الأنابيب الدقيقة الطبيعية أثناء الانقسام الخيطي. الإشارة إلى عدم سمية PST-1P النشطة للجنين. في أفلام الفاصل الزمني المكتسبة ، ظهرت علامات EB3-dTomato كهياكل تشبه المذنبات ، ومكنت من تتبع خيوط الأنابيب الدقيقة المتنامية.
في الأجنة المعالجة PST-1P ، المحفوظة في ظروف مظلمة ، انبثقت مذنبات EB3-dTomato الفردية من الجسر بين الأطوار ، والذي يعمل كمركز تنظيم للأنابيب الدقيقة غير المركزية في جنين الفأر المبكر. يظهر مكدس t مذنبات EB3-dTomato في منطقة الجسر بين الطور. بعد تنشيط PST-1P ، تم تقليل مذنبات EB3-dTomato في قاعدة الجسر بين الأطوار وفي مكدس t.
تذكر أن الضوء الأبيض يمكن أن ينشط PST-1P قبل الأوان. لذا استخدم مصادر الضوء الأحمر فقط للرؤية. يعمل الضوء الأخضر أيضا على إلغاء تنشيط PST-1P ، لذا يرجى تجنب استخدام علامات ملصقات الفلورسنت الخضراء.
وقد استخدمت هذه التقنية في ذبابة الفاكهة والأميبا والفئران وأنظمة المختبر المتعددة ، لاستهداف نمو الأنابيب الدقيقة من أجل دراسة هجرة الخلايا وتكوين الأنسجة.
