هذه الطريقة مهمة لأن المواد العضوية المشتقة من المريض توفر أداة سريعة وقوية لدراسة سرطانات المسالك البولية لأنها غالبا ما تحاكي عدم التجانس الجيني والمظهري لهذا المرض متعدد الطيف. يمكن عزل المواد العضوية من كمية محدودة من مواد خزعة المريض ويمكن توسيعها بسرعة لتحليلها في المراحل النهائية. يمكن استخدام المواد العضوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول كنماذج لمساعدتنا على فهم الأساس الخلوي والجزيئي لسرطانات المسالك البولية وكأدوات الطب الدقيق للسماح لنا بالتنبؤ بالعلاجات والمرضى الفرديين الذين قد يستجيبون للسرطان.
للبدء ، قم بجمع عينة ورم جديدة قابلة للتطبيق عيانية من الجراحة وتأكد من غمر العينة في وسط نقل في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر أو جرة عينة بول أثناء العبور. تسجيل تفاصيل العينة بما في ذلك وزن الأنسجة ووصف العينة والتفاصيل المتعلقة بأي عينات دم وبول على ورقة معالجة عينات المريض. استبدل بعناية وسيط النقل ب 10 ملليلتر من الوسائط القاعدية واسمح لأنسجة الورم بالاستقرار عن طريق الجاذبية.
بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة أنسجة الورم ووضعها في طبق بتري معقم 90 ملم. سجل وزن الأنسجة بالجرام أو الملليغرام على ورقة معالجة العينات السريرية وشبكة التشريح. ثم باستخدام ملقط معقم في شفرة مشرط يمكن التخلص منها مثبتة على مقبض مشرط ، قم بإزالة الأنسجة غير السرطانية والمناطق الميتة المرئية عيانيا.
اغسل قطع الورم مرة أو مرتين باستخدام DPBS البارد ، ثم اجمعها وانقلها إلى طبق بتري جديد معقم 90 ملم. التقط صورة فوتوغرافية وارسم مخططا للأنسجة وخطط لتشريح الأنسجة على شبكة معالجة سريرية. للتحليل النسيجي المرضي ، ضع ما يقرب من 50 ملليغرام من أنسجة الورم في كاسيت الأنسجة البلاستيكية التي يمكن التخلص منها.
ثم قم بغمر كاسيت الأنسجة في حاوية بحجم 5X إلى 10X من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ واحتضانه بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استبدل الفورمالين ب 70٪ إيثانول للتخزين عند أربع درجات مئوية حتى يمكن معالجة الأنسجة. للتحليل الجزيئي ، قم بتجميد قطعة ورم واحدة على الأقل في RNase ، DNase خالية من 1.5 ملليلتر من التبريد باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
بعد ذلك ، قم بتوزيع خمسة ملليلترات من الوسط العضوي في طبق بتري 90 ملم الذي يحتوي على قطع الورم المتبقية وقم بتقطيع الأنسجة ميكانيكيا بأفضل شكل ممكن. باستخدام شفرة مشرط معقمة رقم 10. انقل الأنسجة المفرومة ناعما إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وأضف أربعة ملليلتر من الوسط العضوي ، وملليلتر واحد من 10X كولاجيناز / هيالورونيداز و 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر DNase I لتجنب تكتل الخلايا.
احتضان أنسجة الورم المفروم في محلول إنزيمي لمدة ساعة إلى ساعتين على شاكر مداري أو دوار في حاضنة لفصل الشظايا إلى تعليق خلوي وتحطيم الكولاجين. ثم أوقف عملية الهضم بإضافة ضعف حجم الوسط القاعدي إلى العينة. قم بالطرد المركزي للعينة ، وشفط ، والتخلص من supernatant.
بعد ذلك ، لتحليل خلايا الدم الحمراء الملوثة ، أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات من مخزن البوتاسيوم بكلوريد الأمونيوم واحتضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق أو حتى يتم رؤية التحلل الكامل لخلايا الدم الحمراء. ثم أضف 20 ملليلتر من الوسط القاعدي في الأنبوب. جهاز طرد مركزي مرة أخرى وشفط السوبرناتان.
في هذه الخطوة ، ضع أليكوت 10 ملليلتر من وسط عضوي 2X و 1X في حمام مائي 37 درجة مئوية للتدفئة. قم بتصفية العينة أولا من خلال مصفاة 100 ميكرون قابلة للعكس قبل الرطب في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر لإزالة المواد الكبيرة غير القابلة للذوبان. ثم قم بتصفية العود من خلال مصفاة 37 ميكرون قابلة للعكس قبل الرطب لجمع خلايا مفردة في مجموعات صغيرة لعزل خلية واحدة وخلية مناعية.
بعد ذلك ، عكس مصفاة 37 ميكرون وإضافة 10 ملليلتر من الوسائط القاعدية لجمع مجموعات صغيرة ومتوسطة الحجم. قم بتعبئة كل من هذه الأنابيب الجديدة سعة 50 ملليلتر باستخدام DPBS إلى 40 ملليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للتعليق وتخلص من السوبرناتانت. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من الوسائط القاعدية إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المفردة وعد الخلايا باستخدام صبغة استبعاد تريبان الزرقاء في عداد الخلايا الآلي.
تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلايا. قم بالطرد المركزي للعينة المتبقية واستبدل الوسط بمحلول تجميد الخلايا أو الوسائط القاعدية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني 1٪ بنسلين وستربتومايسين و 10٪ DMSO ، ثم ضع العينات في 1.5 ملليلتر من المبردة ، وتخزينها في حاوية ذاتية التجميد ، ونقل الحاويات على الفور إلى ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل الكريوفيالات إلى سائل مبرد أو تخزين في مرحلة الهواء للتخزين على المدى الطويل.
بعد ذلك ، أعد تعليق المجموعات الصغيرة والمتوسطة الحجم التي تم جمعها مع 500 ميكرولتر من الوسط العضوي 2X الذي تم تسخينه مسبقا. ثم مع الثلج البارد P-1000 نصائح ماصة مرشح معقمة ، إضافة BME إلى الخلايا وتخلط بلطف. قم بسرعة وبعناية بماصة 100 ميكرولتر من خليط الخلايا المعاد تشكيلها BME إلى آبار ذات ملحق منخفض للغاية ، لوحة مسطحة القاع من 96 بئرا ، وضع اللوحة في حاضنة لمدة 20 إلى 30 دقيقة للتصلب.
بعد الحضانة ، أضف متوسطا عضويا فوق تعليق خلية BME بنسبة واحدة إلى اثنتين اعتمادا على الحجم الذي تم تقييمه تجريبيا ، وضع اللوحة في حاضنة لمدة 20 دقيقة لتحقيق التوازن. بعد الحضانة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وقم بتجميعها على حامل عينة على مرحلة المجهر لتقييم المواد العضوية بصريا تحت تباين الطور أو إعدادات المجال الساطع. قم بتعبئة الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام 50 ميكرولتر من الوسط العضوي المسخن مسبقا لتجديد عوامل النمو المستنفدة والحجم الكلي.
احصل على صور سلسلة الفاصل الزمني في الأيام 1 و2 و3 و5 و7 و10 قبل المرور. يؤدي هضم أنسجة سرطان المثانة لمدة ساعتين باستخدام الكولاجيناز / الهيالورونيداز والحمض النووي المتوفر تجاريا إلى هضم كاف من 0.5 إلى 1 قطعة ملليمتر مكعب من أنسجة خزعة استئصال المثانة الأكثر تعقيدا ، بما في ذلك الخلايا الورمية داخل الصفيحة البروبريا والطبقات العضلية للمثانة. شظايا ما بعد الهضم الأكبر حجما مناسبة للزراعة وألواح زراعة الأنسجة القياسية من أي حجم لعزل الثقافات الجديدة ثنائية الأبعاد.
تخضع المواد العضوية الناتجة عن هذا الإجراء للتجميع الذاتي الديناميكي ، بما في ذلك مراحل التجميع والضغط والتكوين النهائي للهياكل الخلوية الضيقة. من الناحية النسيجية ، تلخص هذه الهياكل ورم المريض الأصلي. المواد العضوية المتولدة في هذا الإجراء مناسبة للعديد من الأغراض ، بما في ذلك المزيد من التوصيف النسيجي المرضي ، والبنوك الحيوية ، واختبار فعالية الدواء.
بعد توليد المواد العضوية ، يمكن استخدام طرق إضافية لتحديد ملامح هذه الأورام ، بما في ذلك دور العلاجات المضادة للسرطان ، أو التنميط الأيضي ، أو التنميط النسخي. ضمن هذا الإطار 3D ، توفر هذه المنهجيات الإضافية نظرة ثاقبة قوية في بيولوجيا سرطان المثانة. كانت هذه الطريقة أساسا مهما للدراسات التي تبحث في علم الأورام المناعي والتمثيل الغذائي الخلوي.
