تم تطوير البروتوكول لإنتاج متغيرات الصيد كاملة الطول على مقياس مليغرام منخفض. يسمح ببروتين ثابت عالي الجودة ضروري للباحثين في داء هنتنغتون. سيوضح الإجراء مايكل هاريس ، عالم أبحاث من مختبر كوريا.
ابدأ بإضافة جرام واحد من البولي إيثيلين 25 K إلى لتر واحد من الماء الخالي من السموم الداخلية ، وحركه جيدا. اضبط الرقم الهيدروجيني على 2.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 100 مليمولار وحركه حتى يذوب كل البولي إيثيلين. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم 100 ملليمولار ومرر المحلول عبر مرشح 0.2 ميكرومتر.
اصنع حصصا من المحلول المصفى وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. نشر خلايا HEK293 في وسط النمو المكمل ببنسلين ستربتومايسين في حاضنة شاكر مرطبة عند 37 درجة مئوية ، 90 دورة في الدقيقة ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 إلى 24 ساعة. قبل يوم واحد من النقل ، قم بتخفيف الخلايا بكثافة حوالي 1.2 × 10 إلى خلايا الطاقة السادسة لكل ملليلتر في لترين من وسط النمو في قارورة Erlenmeyer سعة خمسة لترات واحتضانها لمدة 18 إلى 24 ساعة.
في نهاية الحضانة ، قم بقياس كثافة الخلية وصلاحيتها باستخدام عداد خلايا تلقائي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد حساب كمية البولي إيثيلين والبلازميد اللازمة للنقل ، قم بتخفيف البولي إيثيلين والبلازميد بشكل فردي في 100 ملليلتر من PBS واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اخلطي البلازميد المخفف والبولي إيثيلين عن طريق الدوران بلطف واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
أضف الخليط إلى مزرعة الخلايا واخلطه عن طريق الدوران برفق. الآن ، اسمح للخلايا بالنمو لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، أضف محلول زبدات الصوديوم إلى تركيز نهائي من عامل مضاد للتكتل ومضاد للرغوة بمقدار 2 مليمولار بنسبة حجم 1: 1،000 إلى الثقافة واحتضان الخلايا في حاضنة شاكر المرطب لمدة 48 ساعة.
بعد قياس صلاحية الخلية وكثافتها ، احصد الخلايا بالطرد المركزي عند 2،000 جم لمدة 30 دقيقة وقم بتخزين حبيبات الخلية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل التنقية. للتنقية المضادة ل FLAG باستخدام FPLC ، قم بتعبئة 12 إلى 25 ملليلتر من راتنج مضاد FLAG في عمود فارغ بمعدل تدفق يبلغ أربعة ملليلتر في الدقيقة باستخدام المخزن المؤقت A واضبط ارتفاع المكبس لإزالة الفجوة بين نهاية المكبس وطبقة الراتنج. بعد ذلك ، قم بتعليق حبيبات الخلية المذابة في مخزن التحلل البارد وقم بتمرير تعليق الخلية مرة واحدة من خلال خالط عالي القص عند ضغط 1،000 رطل لكل بوصة مربعة.
باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية متوافق ، قم بتوضيح المحللة عند 20،000 G لمدة ساعة واحدة. قم ببرمجة FPLC ضمن نافذة الطريقة ، وقم بتحميل المحللة الموضحة عبر مضخة العينة ، واغسل العمود بأحجام العمود المطلوبة من المخزن المؤقت A و B و C و D والمخزن المؤقت للشطف كما هو موضح في مخطوطة النص. بمجرد الانتهاء من التشغيل ، قم بتحليل 10 ميكرولتر من كسور الذروة باستخدام SDS-PAGE.
اجمع بين كسور الذروة والنقاء المطلوب ووفر ما يقرب من 50 ميكرولتر من الشطف المدمج لمزيد من تحليل SDS-PAGE. ابدأ في موازنة عمود SEC باستخدام FPLC وقم بتحميل شطف مضاد FLAG عبر حلقة فائقة سعة 50 ملليلتر. بعد تشغيل المخزن المؤقت ل SEC ، اسمح بفصل SEC يحدث بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
قارن ملف تعريف الشطف مع ملف تعريف شطف HTT القياسي لتمييز قمم المونومر والدايمر والقمم قليلة القسيمات الأعلى ترتيبا. قم بتجميع كسور HTT الأحادية بناء على ملف تعريف الشطف لعمود SEC ، وإذا رغبت في ذلك ، قم بتجميع كسور HTT قليلة القسيمات و dimeric ذات الترتيب الأعلى بشكل منفصل. ركز بروتين HTT المجمع باستخدام مكثف طرد مركزي 100 كيلودالطن عند أربع درجات مئوية.
بعد حساب تركيز البروتين ، قلص أقل من 100 ميكرولتر من بروتين HTT المنقى في أنبوب طرد مركزي دقيق آمن للتبريد. قم بتجميد القسمة باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإجراء جميع SEC-MALS التحليلية عند أربع درجات مئوية على نظام HPLC ، إلى جانب كاشف الأشعة فوق البنفسجية ، وكاشف تشتت الضوء متعدد الزوايا ، وكاشف معامل الانكسار التفاضلي ، واستخدم 0.185 كزيادة في معامل الانكسار ل HTT.
قم بتطهير المضخة وأجهزة الكشف بمياه HPLC المفلترة وقم بتوصيل عمود UHPLC بالنظام. قم بموازنة العمود بالماء المصفى ثم المخزن المؤقت SEC-MALS حتى تصل جميع إشارات الكاشف إلى خط الأساس. حقن اثنين ميكرولتر من محلول BSA بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لكل حقنة.
افحص جودة البيانات ، وقم بإجراء التسوية ، ومحاذاة الذروة ، وتصحيح توسيع النطاق بناء على ملف تعريف BSA ، وقم بإنشاء قالب لعمليات تشغيل عينة HTT التالية. قم بإذابة قارورة من عينة FL Q23-HTT بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة باستخدام عوامة. قم بتصفية HTT من خلال مرشح دوران 0.1 ميكرومتر.
حقن اثنين إلى أربعة ميكرولتر من عينة HTT وتشغيلها لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة. قم بتحليل بيانات الكروماتوغرافيا وتشتت الضوء باستخدام البرامج المصاحبة وإنشاء مخطط Zimm لتحديد الكتلة الجزيئية المتوسطة للوزن لكل قمة. في الدراسة الحالية ، باستخدام عملية عمود من خطوتين ، تم الحصول على أكثر من 95٪ من النقاء ل HTT وكان الملوث الرئيسي هو chaperone Hsp70 ، والذي تم التخلص منه عن طريق الغسيل المكثف بكلوريد المغنيسيوم و ATP أثناء خطوة تنقية التقارب المضادة ل FLAG يمكن أن يؤدي التعبير المفرط ل FL HTT إلى تجزئة البروتين ولكن FL Q23-HTT الناتج عن الطريقة التي تم حلها كنطاق واحد بالوزن الجزيئي الصحيح البالغ 350 كيلودالتون يشير إلى عدم وجود التجزؤ.
أظهر تحليل اللطخة الغربية بعد تفاعل الأجسام المضادة مع FL Q23-HTT أن البروتين تم عزله دون اقتطاعات كبيرة يمكن اكتشافها ، حيث لم يتم ملاحظة أي نطاقات إضافية مرتبطة بالشظايا. تفاعل تباين طول FL HTT poly-Q و Q23 و Q48 و Q73 كما هو متوقع في اللطخة الغربية ، مما أظهر إشارة أقوى تدريجيا للجسم المضاد أحادي النسيلة الموجه من poly-Q MW1 ، مرتبطا بزيادة طول Q. من بين أعمدة HPLC التي تم اختبارها ، أظهر عمود SEC دقة كافية بين مونومر HTT و dimer ، بحيث يمكن تمييز الكتل المولية.
أظهر FL HTT المنقى من SEC نطاقات متعددة تتوافق مع حالات قلة القلة ، والتي قد تكون بسبب وجود العديد من البقع الكارهة للماء التي تساهم في تكوين oligomers أعلى مرتبة أثناء الهجرة داخل الهلام. أظهر HTT المنقى ثلاثة نطاقات رئيسية على PAGE الأصلي الأزرق بوزن جزيئي يقدر ب 643 و 927 و 1،070 كيلودالتون والتي من المحتمل أن تمثل الأنواع الأحادية والثنائية والثلاثية من HTT ، على التوالي. يعد التعامل السليم مع هنتنغتين المنقى أمرا ضروريا لتجنب توليد أوليغومرات عالية الترتيب في مجاميع قابلة للذوبان.
من الضروري أن يعمل المستخدم النهائي بسرعة لتوزيع العينة في أنابيب مبردة مسبقا قبل التجميد السريع. يمكن إجراء اختبار الثبات طويل المدى على العينات المخزنة في فترات طويلة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. سيؤكد تكرار تحليلات HPLC SEC-MALS ما إذا كان هناك أي تغيير في المحتوى الأحادي للعينة.
