نحن نعرض طريقة لا حصر لها لجميع التحكم البصري ومراقبة النشاط الخلوي المثير في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. تمكين القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان ، والسماح بمراقبة تأثير الأدوية على مدار ساعات أو أيام. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا العصبية أو خلايا بيتا ، للفحص الوظيفي واختبار السمية.
سيوضح الإجراء وان تشي سو ، مهندس التصوير الحيوي من مختبري. قم بإعداد اللوحة متعددة الآبار قبل إزالة الخلايا العضلية القلبية iPSC من التخزين البارد للذوبان. قم بتغطية كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة 96 ب 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين بنسبة 0.02٪ مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الفيبرونيكتين لتغطية جميع الأسطح جيدا.
انقل الخلايا العضلية القلبية iPSC من خزان تخزين النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية. خذ القارورة إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، وانقل المحتويات برفق إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلترات من وسط درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الفائقة بواسطة الماصة ، وأعد تعليق الخلايا بلطف في ملليلتر واحد من الوسط باستخدام 10 مثبطات ميكرومولار ROCK Y27632. قامت خلايا الصفائح بطلاء 96 لوحة بئر بكثافة 100،000 إلى 150،000 خلية لكل سنتيمتر مربع ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد 24 ساعة ، تأكد من أن الخلايا المتصلة بسطح اللوحة على اتصال بالخلايا الأخرى.
بعد طلاء الخلايا لمدة 72 ساعة تذوب مجموعات GECIs الفيروسية على الجليد. قم بإعداد حل مخزون مجموعة فيروسية مزدوجة القوة باستخدام وسيط الصيانة. قم بإعداد الخلايا للعدوى عن طريق ضبط الحجم المتوسط إلى 100 ميكرولتر لكل بئر.
أضف 100 ميكرولتر من المحلول الفيروسي المخلوط مسبقا إلى الآبار ، واحتضنها لمدة ثماني إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استبدل ب 200 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا. تصور تعبير GECIs بعد 24 ساعة من النقل باستخدام نظام تصوير.
الحفاظ على الخلايا في الحاضنة المرطبة قبل إجراء الفحوصات الوظيفية. قم بتشغيل جميع أجهزة نظام التصوير عالي المحتوى. تحقق من أن درجة حرارة الغرفة تصل إلى 37 درجة مئوية مع مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
افتح برنامج التصوير ، واختر إعداد اللوحة للوحة 96 بئرا. ضع صفيحة بئر 96 غير مغطاة في الغرفة ، وقم بتحميل حلقة ختم الخلايا الحية في الأعلى. اختر العدسة الموضوعية للغمر بالماء 20X و 60X و 20X ، وفقا للدقة المكانية المطلوبة.
اضبط التركيز البؤري لالتقاط صور واضحة قبل الاكتساب التجريبي. حدد ثلاث إلى خمس مناطق عشوائيا لكل بئر لتسجيل نشاط الكالسيوم. اختر الفلاتر المناسبة للمؤشرات المختلفة.
اضبط طاقة الصمام الثنائي الباعث للضوء المناسبة لكل قناة تصوير مستخدمة. اضبط وقت التعرض للكاميرا على 40 مللي ثانية أو 25 هرتز كحد أقصى، ومدة تسجيل تبلغ 30 ثانية للحصول على التيار لمراقبة انتقالات الكالسيوم، التي أبلغت عنها مجسات MNG-GECO وK-GECO المعبر عنها في الخلايا العضلية القلبية. قم بزيادة طاقة LED إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل من اثنين بمعدلات إطارات أعلى.
للتحفيز البصري الوراثي ، قم بتحسين قوة وتردد الضوء الأزرق عند هرتز واحد ، وابدأ في الاكتساب. أعد تعليق E4031 Dofetilide و Verapamil في DMSO ، وقم بتخفيفهما باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. ترتيب المركبات إلى الهدف المقابل جيدا.
أضف 100 ميكرولتر من مركب القوة المزدوجة عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي إلى الآبار ، وابدأ في الاستحواذ بعد فترة الحضانة المطلوبة. اعزل منطقة الإشارة عن الخلفية عن طريق الكشف تلقائيا عن ميزة النبضات ، مع مرور الوقت ، باستخدام البرنامج. استخدم برنامج تحليل ذروة الكالسيوم لتحليل تردد الضرب ، وإشارة الذروة ، ومدة عبور الكالسيوم 50٪ مدة الكالسيوم العابرة 90٪ وقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال.
يتم عرض ملاحظة تذبذب الكالسيوم التلقائي في NMG-GECO المعبر عنه بواسطة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC مع أو بدون علاجات دوائية في الفيديو. أظهرت الآثار الحركية التي تم الحصول عليها باستخدام MNG-GECO أن مثبطات قناة الأيونات الجزيئية الصغيرة Verapamil و Dofetilide و E4031 أثرت على انتقالات الكالسيوم كما هو متوقع. لتقييم استجابة جرعة E4031 في ظل ظروف موحدة وسريعة ، تم التحكم في قناة روديبسين-2 ، و K-GECO التي تعبر عن iPSC CMs بصريا باستخدام هرتز واحد ونبضات ضوء 470 نانومتر ، وتمت ملاحظتها باستخدام إشارة K-GECO الحمراء.
تحدث التخفيضات التدريجية في سعة الذروة ، والزيادة في وقت اضمحلال عابرات الكالسيوم ، مع زيادة تركيزات E4031. كان التأثير المعتمد على الجرعة من E4031 أكثر وضوحا للتخفيضات في سعة الذروة. تظل عابرات الكالسيوم الواضحة مرئية بعد شهر من النقل الفيروسي ، أو بدون الضوء الإضافي المستخدم في الوتيرة البصرية.
يصور الرسم البياني دواء يبدو أنه يزيد من معدل الضربات ، ويحدد فترة الانكماش ، ويزيد من سعة الكالسيوم العابرة ، في وضع LVNC iPSC CM. يتغير أيضا تباين تردد النبض ، والتأثير اللاحق على مدة الكالسيوم العابرة ، حيث يتم الحفاظ على iPSC CM في الثقافة. تم تطوير العديد من GECIs ، بما في ذلك ، ER LAR-GECO ، MTG-SEPIA ، و NIR-GECO ، للتعبير بشكل فردي ، أو في تركيبة في نماذج الخلايا لقياس نشاط الكالسيوم في الوقت الفعلي الناشئ في الشبكة الإندوبلازمية ، والشبكة الساركوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والسيتوسول ، على التوالي.
يمكن دمج GECIs في نموذج iPSC CM لدراسة مخازن الكالسيوم المختلفة داخل الخلايا. أظهر K-GECO الذي يعبر عن الخلايا العضلية القلبية سلوكا ثابتا للضرب بمرور الوقت. ومع ذلك ، أثر تحميل Fluo-4 على كل من تردد الإيقاع و CTD في هذا النموذج ، مما يشير إلى أن Fluo-4 ، نفسه ، قد يؤثر على نتائج مثل هذه التجارب.
نحن نقدم طريقة بسيطة لدراسة ملامح النمط الظاهري من الخلايا الضابطة والمشتقة من المريض ، في حين أن iPSC الوسيط قد يلقي الضوء على اكتشاف الأدوية في أمراض مختلفة.
