القابلية للتكرار هي مصدر قلق كبير عند تحفيز خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية. باستخدام هذه الطرق، يمكن توليد نقاء عالية وعالية الجودة cardiomyocytes من iPS لاستخدامها في الدراسات الوظيفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بسيطة وموثوقة وفعالة من حيث التكلفة ، وطريقة قوية للغاية للحصول على تنقية ، وإعدادات عالية الجودة من القلب المشتقة من iPSC.
بالنسبة لتمرين الخلايا ، شطف الخلايا بميليلتر واحد من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة سبع إلى 10 دقائق قبل استبدال PBS بميليلتر واحد من وسيط التمرير. باستخدام رافع الخلية، كشط بلطف الخلايا من الجزء السفلي من الآبار، واستخدام ماصة الزجاج ملليلتر المعقمة لفك الخلايا المنفصلة ميكانيكيا. عندما رفعت الخلايا إلى مجموعات صغيرة كما مرئية تحت المجهر إضافة متوسطة تمرير لتقسيم الخلايا في نسبة واحد إلى ستة.
بعد ذلك، pirate الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة من لوحة ستة بئر. ثم إضافة ملليلتر واحد من متوسط التمرير ومليلتر واحد من الخلايا المنفصلة إلى كل بئر ، والسماح للخلايا تنمو حتى تصل إلى 70 إلى 80 ٪ التقاء قبل البدء في تمايز القلب. على الأقل 30 دقيقة قبل فصل iPSC-CMs، مسح زلات الغطاء الزجاجي الفردية مع 70٪الإيثانول، ووضع الغطاء ينزلق في آبار فردية من لوحة ستة بئر معقمة.
عندما تجفيفت زلات الغطاء، إضافة 250 إلى 300 ميكرولترات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حل المصفوفة المؤهلة مباشرة على مركز كل زلة الغطاء، ووضع لوحة ستة جيدا في غطاء الأنسجة ثقافة. لفكّر iPSC-CM المحدد أيضًا بإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تبربسين مع EDTA إلى كل بئر لمدة خمس دقائق حضانة عند 35 درجة مئوية، واستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لفك الخلايا ميكانيكيًا حتى يتحقق تعليق خلية واحدة. سحب الخلايا في أنبوب مخروطي مخروطي 15 ملليلتر معقمة، وغسل كل جيدا مع مليلترين من RPMI 20 المتوسطة في بئر.
ثم تضاف يغسل إلى أنبوب بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend الخلايا في حجم كاف من المتوسطة لتحقيق ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 250 ميكرولترات من تركيز الخلايا. استخدام 1000 ملليلتر ماصة تلميح لتفكك الخلايا حتى الحل يبدو أن متجانسة.
ثم pirate 250 ميكرولترات من الخلايا في 1000 ميكرولتر ماصات تلميح، وببطء الاستغناء عن حجم كامل من الحل على واحد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة زلة الغطاء المرمز. عندما تم زرع جميع الخلايا ، ضع اللوحة بعناية في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. إضافة بلطف مليلترين من D7 المتوسطة إلى كل بئر في صباح اليوم التالي.
عندما حدد iPSC-CMs تصل إلى ما لا يقل عن ثلاثة أشهر من العمر علاج الخلايا مع اثنين من ميكرولترات من فورا-2 ص لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية، والطاقة على نظام تحليل الكالسيوم. بدء ArcLamp وربط الأنابيب من المضخة إلى المداخل المناسبة ومنافذ والأسلاك الإلكترونية من محفز إلى الغرفة. ضع الغرفة على النظام.
املأ أنبوب ProFusion الذي يمر عبر سخان سائل مع محلول تيرود 37 درجة مئوية، وضبط أبعاد فتحة الكاميرا وتأطيرها لتقليل مساحة الخلفية. قم بـربط الغطاء الزجاجي بذرة مع iPSC-CMs في الغرفة ، وأضف بلطف 500 ميكرولترات من حل Tyrode مباشرة فوق زلة الغطاء. ابدأ في استخدام الغرفة مع محلول Tyrode بمعدل 1.5 ملليلتر في الدقيقة ، واستخدم محفزًا كهربائيًا لوتيرة iPC-CMs مع تحفيز حقل 1 Hertz بمعدل 10 فولت كل أربع مللي ثانية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
عندما تم غسلها كل من صبغة من الغرفة ضبط نافذة العرض إلى المنطقة اليسرى العليا من زلة الغطاء، والبدء في التسجيل. بعد جمع تيار ثابت من خمس إلى 10 قمم انقر وقفة لوقف التسجيل مؤقتا ونقل مرحلة المجهر إلى منطقة مجاورة للنهاية المقابلة للغطاء قبل استئناف التسجيل. بعد مسح الترانبينس الكالسيوم عبر زلة الغطاء بأكمله بنفس الطريقة على مدى فترة 10 دقائق تحليل البيانات مع برنامج تحليل تتبع الفلوريس مناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
يولد هذا البروتوكول القلبية النقية للغاية التي تكتسب بطيني ، مثل نمط ظاهري بالغ في الثقافة مع مرور الوقت. كما تم تقييمها بواسطة تلوين الفلورسنت المناعية لثائر MLC2 الأذينية والبطينية، فإن غالبية الخلايا الناتجة عن هذا البروتوكول هي أذيني MLC2 isoform في اليوم 30 بعد تحريض تمايز القلب. بينما يتم التعبير عن الشكلين متساويي MLC2 البطيني في كثير من الأرقام في نفس النقطة الزمنية.
كما يزيد الوقت في الثقافة، يتم ملاحظة التحول الكامل إلى isoforms MLC2. وقد تأكدت هذه البيانات أيضاً من خلال القياس الكمي للتدفق من النسبة المئوية لثنمتر MLC2 الأذيني والبطيني. زيادة سعة الكالسيوم بشكل كبير في iPSC-CMs في اليوم 90، على غرار تلك التي لوحظت لCMs الفئران الكبار.
من المهم ملاحظة أن تلويث الخلايا غير القلبية قد يؤثر على النضج الوظيفي لـ iPSC-CMs البشري أثناء التمايز. علاوة على ذلك ، عندما يسجل العابرون الكالسيوم في iPSC - CMs من الضروري السماح للخلايا بالثبات عند 37 درجة مئوية تحت التحفيز المستمر لمدة 200 ثانية على الأقل ، وتقييد التسجيلات في نافذة زمنية محددة لضمان النتائج القابلة للتكرار. تذكر أن تؤكد أن iPSCs يحمل مورفولوجيا متجانسة والسماح للخلايا لتنمو إلى 70 إلى 80٪ التقاء قبل بدء التمايز القلب.
قد تظهر الجودة النقية في القلب المشتق من iPS غير الناضجة الخصائص الوظيفية المتغيرة ، والتي لا تعكس النمط الظاهري الحقيقي ، ولكن يمكن إساءة تفسيرها على أنها النمط الظاهري المريض. ولذلك، الحصول على نقية وعالية الجودة cardiomyocytes المهم لتوفير نتائج متسقة وقابلة للتكرار.
