حتى الآن ، فإن الأعضاء الدماغية المتمايزة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات هي نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر الأقرب إلى أنسجة الدماغ البشرية الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأعضاء الدماغية مناسبة بنفس القدر لنمذجة أمراض الجهاز العصبي المركزي المختلفة ، واختبار المواد النشطة دوائيا ، وكذلك للاستخدام في الطب التجديدي. وفي الوقت نفسه، لا تزال هذه التكنولوجيا في المرحلة الأولى من التطوير.
ويمكن تقسيم البروتوكول إلى مجموعتين تبعا لطريقة الحصول على المجاميع وزراعة مزيد مع التمايز. الأول يتضمن بروتوكول ومخططات التمايز، مختلفة في وقت الزراعة ومحرضات التمايز مع النضج اللاحقة من organoid في شاكر في أجهزة خاصة منخفضة التصاق مثل أنابيب السوق أو لوحات. وتشمل مجموعة أخرى استخدام المفاعلات الحيوية الخاصة.
وقد أظهر تحليل البروتوكولات المختلفة أنه ينبغي زراعة الأجهزة العضوية في ظل ظروف ذات وسيطة غذائية متداولة. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أنظمة بسيطة وغير مكلفة للحصول على الجهازية ذات الحجم القياسي والمورفولوجيا تتطلب تطوير مثل هذه الأجهزة لتوسيع نطاق العملية. في هذا العمل، ونحن نصف طريقتنا للحصول على واختبار المفاعلات الحيوية البسيطة وغير مكلفة الصغيرة التي تجعل من الممكن الحصول على كميات كبيرة من الأجهزة عالية الجودة.
قطع أنابيب الطرد المركزي العقيمة 15 ملليلتر في الحلقات، 7 أو 8 ملليمترات في الارتفاع. أوتوكلاف الحلقات. كسر التجمعات المنخفضة على أطباق بيتري المعالجة أو الميكروبيولوجية إلى فتات.
حل حوالي 1 غرام من فتات البلاستيك في 10 ملليلتر من الكلوروفورم بين عشية وضحاها لإعداد البلاستيك السائل. جعل مقبض بلاستيكي في وسط طبق بيتري فائقة الالتصاق 6 سنتيمترات العقيمة. هناك طريقتان مناسبتان بنفس القدر.
الأول، وضع الأوتوكلاف في حلقة بلاستيكية على مركز وتطبيق نصف ملليلتر من البلاستيك السائل إلى داخل الحلبة. والثاني، دون أي حلقات بلاستيكية إسقاط نصف ملليلتر من البلاستيك السائل على وسط طبق بيتري. اترك الأطباق مفتوحة لمدة ساعتين أو ثلاث ساعات في غطاء تدفق صفح حتى يجف تماما.
زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في الوسط للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ما يصل إلى 75 أو 90٪ التقاء في أطباق بيتري 35 ملليمتر ، المغلفة مسبقا بمصفوفة مذابة في دولبيكو متوسط النسر المعدل البارد ، وفيشر-12 المتوسطة. إعداد المتوسطة A زائد استبدال المصل. زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لمدة يوم واحد في الوسط مع استبدال المصل.
تغيير المتوسطة للخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى وسيط استبدال المصل في اليوم صفر من التمايز. إعداد متوسط A.Change المتوسط إلى المتوسط A في اليوم الثاني من التمايز. زراعة الخلايا في المتوسطة A لمدة 2 أسابيع، منعش المتوسطة في أطباق بيتري كل 2 يوم.
في اليوم 14، بدء تشكيل كروية باستخدام لوحة خاصة ثقافة 24 جيدا الذي يحتوي على ما يقرب من 1200 ميكروويل في كل بئر. إعداد لوحة ثقافة 24 جيدا مع microwells. أضف إلى كل بئر 1 ملليلتر من المتوسط A، الطرد المركزي لفترة وجيزة في 1، 300g لمدة 5 دقائق في الدوار يتأرجح دلو مزودة حامل لوحة.
السيطرة تحت المجهر أنه لا توجد فقاعات في microwells. إعداد B.Remove المتوسطة المتوسطة من طبق بيتري. مفرزة الخلية، علاج الخلايا مع 1.5 ملليلتر EDTA الحل المعدة على برنامج تلفزيوني.
السيطرة على مفرزة الخلية تحت المجهر. حصاد الخلية في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة 5 ملليلتر مختلطة دولبيكو وفيشر المتوسطة في أنبوب نحو الخلايا.
الطرد المركزي في 200g لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا العملاقة وإعادة تعليق في 2 ملليلتر من B.Transfer المتوسط تعليق الخلايا التي تحتوي على 1 مليار خلية في كل بئر من لوحة 24 جيدا مع microwells. خلايا ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات والطرد المركزي لفترة وجيزة 100g لمدة 1 دقيقة لالتقاط الخلية في microwells.
السيطرة تحت المجهر أن يتم توزيع الخلية بالتساوي في microwells. احتضان لوحة بين عشية وضحاها لتجميع الخلايا في كرويدات. في صباح اليوم التالي، اليوم 15، تحقق تحت المجاهر من جودة كرويدات، والتي هي شفافة وسلسة إذا كانت صحية.
جمع بعناية كرويدات من كل بئر في أنبوب 15 ملليلتر، وترك كرويدات للتعجيل بالجاذبية لمدة 2 و 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant. إضافة إلى كرويدات 2 ملليلتر من المصفوفة، إذابة وسابق مؤقت على الجليد. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
لغسل الزائدة من المصفوفة، إضافة إلى أنبوب 8 ملليلتر من B.Pipette المتوسطة بلطف، ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 1 دقيقة في 100g. أزل الناتنات الفائق. إضافة إلى أنبوب 20 ملليلتر من B المتوسطة، ماصة بلطف، ثم تقسيم تعليق كروية بين المفاعلات الحيوية المصغرة.
ثم ضع المفاعلات الحيوية المصغرة في طبق بيتري طوله 15 سنتيمترا ، مما يمنع تبخر الماء والتلوث. وضع طبق بيتري مع المفاعلات الحيوية المصغرة على شاكر المدارية. زراعة organoids بمعدل دوران 70، 75rpm.
في اليوم 16، قم بإعداد الجهازي المتوسط C.Transfer إلى أنبوب 50 ملليلتر. لمدة 5 دقائق، دعهم يسقطون إلى الأسفل. يستنشق supernatant وإضافة 5 ملليلتر من C.Rejoin المتوسطة organoids في المفاعلات الحيوية المصغرة.
زراعة كرويدات في المتوسط C لمدة 2 أسابيع، منعش المتوسطة كل 2 أيام. خلال هذه الأسابيع 2، حدد حوالي 100 كروية لكل المفاعلات الحيوية المصغرة للزراعة التالية. في اليوم 30، إعداد متوسطة D.Change زراعة المتوسطة إلى المتوسطة D، وهو وسيط النضج.
تحديث زراعة المتوسطة كل 2 أو 3 أيام لمدة 3 أسابيع. ثم استخدم متوسط D المذاب في F و GDNF. بعد شهر واحد من الزراعة المتتالية في المتوسط A و B ، يتم الحصول على الأجهزة العضوية الموحدة في الحجم والمورفولوجيا.
كما أنها تنمو، فإنها تحتاج إلى تغيير المتوسطة في كثير من الأحيان، تصل إلى 4 مرات في الأسبوع يزيد أيضا. بعد شهرين من الزراعة ، يصل قطرها إلى 4 و 5 ملليمترات. وبعد شهر آخر، 5 و 6 ملليمترات ويتوقف النمو.
يظهر الشكل مظهر إنزيم الجهاز ، وأقسام واضحة مرسومة بالهيماتوكسيلين والإيوسين. يظهر التحليل المناعي الكيميائي لمدة شهر وجود مجموعات إيجابية من خلايا السلف SOX2 ، بما في ذلك داخل الجزء المركزي. في المحيطية من organoids، بروتين حمضي الرجفان الدبقية، والبروتين المرتبطة microtubule 2، وهيدرولاس الثيازين إيجابية.
وتتركز الخلايا، والتي تتوافق مع شكل ناضج من الخلايا العصبية. في بعض الحالات ، تتشكل مجموعات من البيض على منطقة نخرية في الجزء المركزي. وهذا يشير إلى تقييد هذا البروتوكول للحصول على أكبر organoids.
على الأرجح، فإن العامل المقيد للنمو هو معدل انتشار المواد الغذائية والأوكسجين. وسائل الإعلام المختلفة ونوع الخلية من كرويدات واختبار نظامنا لبعض أنواع organoids. الكثير من الدماغ والشبكية، والأعضاء مجتمعة من خلايا سرطان الكبد والخلايا الجذعية mesenchymal، organoids مجتمعة من العاصمة انفجار المكالمات الجذعية mesenchymal والخلايا الجذعية الدموية التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والأعضاء الأمعاء.
هل كان متغيرا في التكوين الأولي للخلايا؟ عوامل التمايز، والثقافة، والمتوسطة، مصفوفة خارج الخلية، وربما أيضا تكوين خليط الغاز، ومعدل دوران منصة، وغيرها من المعلمات. سيكون من الممكن الحصول على الجهازية بنفس الشكل والحجم أو نموذج مورفولوجيا في مختلف الأجهزة والأنسجة.
استخدام المفاعلات الحيوية المصغرة المقترحة في هذا العمل.
