يمكن أن تكون نماذج نزيف الذيل أدوات مهمة لتقييم الآثار الدوائية للمركبات المرقئة في الجسم الحي لضمان قابلية التكاثر بين التجارب. بالمقارنة مع نماذج النزيف الحساسة الأخرى ، يستخدم نموذجنا فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية بدلا من البقاء على قيد الحياة. أيضا ، يتم تنفيذ النموذج تحت التخدير ، وبالتالي تقليل الألم والضيق للحيوانات.
هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسة قبل السريرية للهيموفيليا واضطرابات التخثر الأخرى ، لأنها تقيس قدرة الدم على التجلط ووقف النزيف بعد الإصابة. لقد استخدمنا هذا النموذج على نطاق واسع ، واختبرنا مركبات التخثر في عملنا لتطوير علاجات جديدة للهيموفيليا باستخدام فئران الهيموفيليا أ. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات الفئران الهيموفيليا الأخرى ، أو الفئران التي يتم فيها تحفيز الهيموفيليا بجسم مضاد للعامل الثامن.
ستعرض التجربة سارة ودينيس ، وهما تقنيان خبيران في مختبري. بعد تخدير الماوس ، ضعه على صفيحة تسخين وتأكد من أن الأنف في مخروط الأنف. ضع مرهما مناسبا للعين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
ضع علامة على الذيل بقطر 2.5 ملم باستخدام كتلة علامة الذيل ، مع الحرص على عدم إجبار الذيل على الدخول في الشق والتأكد من أنه مناسب بشكل مريح. ثم ضع الذيل في الأنبوب الملحي لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان وجود وريد ذيل دافئ مثالي للجرعات الوريدية. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء الجرعات الوريدية بعد خمس دقائق.
ثم ضع غطاء بلاستيكيا فوق الماوس لتقليل فقدان الحرارة. اترك الذيول مغمورة لمدة خمس دقائق بعد اختبار جرعات المحلول ، ثم قم بإجراء تحويل الوريد الذيل عن طريق وضع الذيل في كتلة القطع وقلبه 90 درجة لفضح الوريد. قم بإجراء القطع على الجانب الآخر من المكان الذي تم فيه إعطاء محلول الاختبار.
ارسم شفرة المشرط رقم 11 من خلال شق كتلة القطع ، مع الاحتفاظ بالذيل ، لخلق نزيف. ثم ، أعد الذيل على الفور إلى المالحة وأعد ضبط ساعة التوقيت. يجب أن يكون النزيف مرئيا على الفور.
يعد غمر الذيل في محلول ملحي أمرا مهما للنزيف المستمر ، لأنه سيتوقف بسرعة في الهواء الحر. راقب النزيف على بداية النزيف وتوقفه طوال 40 دقيقة على ورقة تدوين تدفق الدم. قم باستبعاد الماوس واستبداله إذا لم يتوقف النزيف الأولي في غضون ثلاث دقائق بعد إجراء القطع ، مما قد يشير إلى أن القطع عميق جدا أو أن الماوس يعاني من نقص في الإرقاء الأولي.
تحدى قطع الذيل إذا لم يكن هناك نزيف ، 10 و 20 و 30 دقيقة بعد الإصابة. باستخدام مسحة شاش مبللة ومالحة دافئة ، ارفع الذيل من المحلول الملحي وامسحه بهدوء ولكن بحزم مرتين باستخدام الشاش الرطب في اتجاه بعيد فوق قطع الذيل. قم بإعادة غمر الذيل على الفور في الأنبوب الملحي بعد كل تحد.
عند الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الذيل من المياه المالحة ، وجمع عينات الدم إذا رغبت في ذلك ، والقتل الرحيم للفئران بينما لا تزال تحت التخدير الكامل. الطرد المركزي لأنابيب جمع الدم سعة 15 ملليلتر مع محلول ملحي عند 4000 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت من الأنابيب.
أعد تعليق الكريات في ملليلتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء. ثم قم بتخفيفه بما يصل إلى 12 ملليلتر إضافي من محلول التحلل حتى يصل إلى لون قهوة فاتح. لاحظ الحجم الكلي وانقل ملليلترين من التخفيف إلى أنبوب الهيموغلوبين.
ضعيه في الثلاجة حتى يتم تحليل الهيموغلوبين. لوحظ انخفاض كبير في فقدان الدم لمجموعات علاج عامل التخثر المؤتلف الثامن باستخدام البروتوكول الأمثل. أدت جرعة 20 وحدة دولية لكل كيلوغرام إلى تطبيع النزيف تماما ، وتسبب 10 وحدة دولية لكل كيلوغرام في تأثير كبير ، مما قلل من فقدان الدم تقريبا إلى الحد الأعلى لنطاق النوع البري.
لوحظت نتائج مماثلة لوقت النزيف. لوحظ انخفاض في مجموعات 5 و 10 و 20 وحدة دولية لكل كيلوغرام ، حيث تم تطبيعه بالكامل في مجموعة 20 وحدة دولية لكل كيلوغرام. في الفئران من النوع البري ، تراوح إجمالي فقدان الدم من 200 إلى 840 نانومول من الهيموغلوبين ، وفي فئران المركبات ، من 5،300 إلى 7،100 نانومول من الهيموغلوبين.
كان متوسط النزيف 5،200 نانومول في الفئران المعالجة بالمركبات ، و 720 نانومول في مجموعة 20 وحدة دولية لكل كيلوغرام. وتراوح وقت نزيف الفئران من النوع البري من دقيقة إلى تسع دقائق، وخفضت مستويات الجرعة البالغة 10 و20 وحدة دولية لكل كيلوغرام وقت النزيف إلى داخل هذا النطاق. لوحظت علاقة قوية بين فقدان الدم ووقت النزيف في البيانات المجمعة.
تم تخطيط جميع نوبات النزيف المسجلة لتوفير تصور لطول وعدد النزيف الذي حدث لكل ماوس على حدة. لاحظ أنه في مجموعة المركبات ، بعد التحدي الثاني ، تستمر معظم الحيوانات في النزيف حتى نهاية التجربة. أكد قياس تركيز عامل البلازما الثامن أن التأثير الذي لوحظ في الحد من فقدان الدم ووقت النزيف كان يعتمد على تركيز العامل الثامن المؤتلف.
ولم يتأثر تعداد الصفائح الدموية بشكل ملحوظ، وكانت مستويات الهيماتوكريت ضمن المعدل الطبيعي لدى الحيوانات التي تتلقى جرعات معتدلة وأعلى من العامل المؤتلف الثامن، ولكنها كانت أقل بكثير في الحيوانات التي نزفت على نطاق واسع، كما هو الحال في السيارة ووحدة دولية واحدة لكل كيلوغرام من المجموعات. في الحيوانات التي تعاني من نزيف حاد ، يمكن أن يحدث تأثير طفيف على تعداد الدم ، وخاصة الهيموغلوبين الكلي أو الهيماتوكريت. لتقييم تأثير الجنس في هذا النموذج الأمثل ، خضعت كل من نتائج فقدان الدم ووقت النزيف لتحليل ANOVA ثنائي الاتجاه ، مع الجنس والجرعة كعوامل.
وأشارت هذه النتائج إلى أن الاستجابة للعلاج لم تختلف بين الجنسين. يعد وضع العلامات الصحيحة على الذيل وإنشاء القطع من الخطوات الأساسية لضمان الموثوقية والتكرار في التقنية ، كما هو التحدي إذا لم يكن هناك نزيف. علاوة على ذلك ، فإن تحريض التخدير الجيد والحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان له أهمية خاصة.
لقد استخدمنا هذا النموذج أيضا للتحقيق في وقف النزيف الثابت في بيئة أكثر شبها بالطلب من خلال العلاج بالعامل السابع بعد 10 دقائق من التسبب في النزيف.
