والهدف من هذا الإجراء هو تقييم تنظيم microtubule والديناميات في الجسم الحي. الخلايا العصبية هي خلايا مستقطبة مع مقصورات عصبية وdendritic ومتشابكة متميزة ، يتم الحفاظ عليها من خلال الهيكل الخلوي الأساسي. تشكل الخلايا الدقيقة غالبية الهيكل الخلوي العصبي ، وتحدد الديناميكيات والتوجه الأحداث الرئيسية أثناء تطور الخلايا العصبية ونضجها.
تتكون الأنابيب الدقيقة من، ألفا وبيتا توبولين heterodimers، ومستقطبة بطبيعتها مع نهايات زائد ديناميكية للغاية ومستقرة ناقص نهايات. خلال البلمرة في الغايات الزائدة ، وهو مجمع متعدد الجزيئيات من البروتينات ملزمة نهاية ، والمنتسبين عابرة مع protofilaments وتعزيز تجميع الدرنات dimers. هذه التقنية ستساعدنا على تصور الميكروبات العصبية في الجسم الحي.
باستخدام هذه التقنية، يمكن للمرء تحديد اتجاه والمعلمات الأخرى من microtubules الحيوية أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية C.elegans. نحن عادة استخدام هذا المراسل لتصور ديناميات microtubule في الخلايا العصبية الحسية. ومع ذلك، يمكن للمرء أن يعبر عن هذا المراسل في أنواع الخلايا الأخرى مثل العضلات والجلد لتصور microtubules ديناميكية في هذه الخلايا.
Fluorescently المسمى نهاية ملزمة البروتينات مثل EBP إلى GFP هنا ، تظهر كمذنبات. وقد ارتبطت ديناميات هذه المذنبات بالنمو المصاحب للميكروبات، ومؤشر رئيسي لقياس ديناميات الميكروتبول واتجاهه. من أجل مراقبة هذه المذنبات في نوع معين من الخلايا، يتم التعبير عن المتحولين جنسيا مع الحمض النووي من EBP-2 و GFP تحت مروج معين.
للتعبير في الخلايا العصبية PLM، يتم التعبير عن هذا المتحول تحت جعل للمروج. يمكن مشاهدة هذه الديدان المعدلة وراثيا تحت مجهر ستيريو ، مع إعداد الفلورسينس قبل الفرز أو التركيب. لتركيب الديدان لتصوير المذنبات EBP، ونحن جعل 10٪ أرغوس في المخزن المؤقت M9.
ووضع قطرة على شريحة زجاجية. يتم استخدام شريحة أخرى للضغط على قطرة في فيلم أن يتماسك في لوحة. نحن نستخدم 0.1 ميكرون، حبات البوليسترين كوسيلة تصاعد، يتم انتقاؤها عدد قليل من الديدان وإعادة تعليقها في حل حبة.
يتم صيد زلة غطاء لشل حركة الديدان وتؤخذ للتصوير. يمكن تصوير تلك المثبتة على أي مجهر مضان مع كاميرا للتصوير عالي الدقة. تم تجهيز الإعداد مع وحدة القرص الغزل للحصول على أسرع وتقليل تبييض الصور وسمية الصورة.
يتم الاحتفاظ الشريحة على خشبة المسرح ومجال الديدان تركز وتتركز باستخدام الإضاءة مشرق الميدان. يمكن استخدام هدف التكبير المنخفض مثل 5X أو 10X لهذا الغرض. يمكن إعادة تركيز الديدان على هدف تكبير عالي مثل 63X باستخدام نفس الإضاءة.
ويوفر هذا الهدف دقة مكانية مثالية لتصوير المذنبات. يتم توسيط ثابت للخلية العصبية PLM تحت الإضاءة الفلورية لمنع التعرض للضوء لا مبرر له وتبييض الصورة من prum. للحصول على صورة نستخدم إرسال البرامج من المواقع.
باستخدام تكوين التصوير الحي في قناة brightfield ، نركز منطقة ذيل الدودة ونركزها في حقل العرض. ويتبع ذلك تركيز الخلايا العصبية PNM باستخدام تكوين التصوير الضوئي مع ضوء الإثارة 488 نانومتر. بالنسبة لاكتساب الفاصل الزمني، يتم إنشاء إعداد تجريبي حيث يحدد وقت التعرض ومدة الفاصل الزمني والفاصل الزمني بين الإطارات المهارات الزمنية للتصوير.
للقياسات الكمية بعض الأفلام من المذنبات EBP هي التي يتعين تحليلها على صورة J، وهو برنامج مفتوح المصدر. يفتح الفاصل الزمني المكتسب كخيط متعدد الصور ، يمكن معاينته كفيلم. في هذه الفاصل الزمني خاصة، يمكن رؤية المذنبات في جسم الخلية، عملية الأمامي والخلفي من الخلايا العصبية PLM.
المذنبات التي تبتعد عن جسم الخلية تصنف على أنها زائد نهاية التدريجي، وتلك التي تتحرك نحو جسم الخلية تصنف على أنها ناقص نهاية التدريجي. لبدء التحليل يتم رسم خط مجزأة على المنطقة ذات الاهتمام، والتي في هذه الحالة هي العملية الداخلية للخلية العصبية PLM. يتم تحويل هذا الجزء الخط إلى kymograph باستخدام وظيفة إعادة تشريح الصور.
وkymograph هو صورة الوقت المسافة مع التجاعيد قطري تمثل المذنبات تتحرك. يمكن رسم شرائح الخط المستقيم على هذه الآثار ويمكن تعيين معلمات القياس باستخدام قائمة التحليل. يمكن تحويل هذه المعلمات إلى كميات ووحدات قياسية قابلة للقياس في برنامج تحليل البيانات مثل Excel.
عرض التتبع يتوافق مع طول النمو. يمثل hight مدة النمو ، وزاوية التجعد تعطي اتجاه المذنبات. ويمكن تصنيف هذه المذنبات كذلك إلى زائد نهاية التدريجي وناقص نهاية التدريجي، للعثور على التوجه النسبي لل microtubules.
يمكن تكييف التعبير المعدل وراثيا عن EBTA GFP لمراقبة ديناميكيات microtubule في سياق خلوي مختلف ، مثل التجديد الجديد. لمراقبة ديناميات microtubule في المنطقة تصنيف المحاور، وأصيب المحور باستخدام ليزر femtosecond، والتي يمكن أن تقطع المحور على وجه التحديد دون التسبب في أضرار جانبية هائلة. بعد الإصابة ، يمكن استرداد الديدان على لوحات المحرك المصنفة للملاحظات اللاحقة.
تظهر الخلايا العصبية PLM تجديدا قويا للكفر ، والذي يمكن ملاحظته في وقت مبكر بعد ست ساعات من الإصابة. لمنع السمية الضوئية لتجديد حقوق جديدة ، يتم إجراء التصوير الحي في مجهر قرص الغزل. ويمكن فيما بعد تحويل عمليات اقتناء المحاور المتجددة إلى كيموغراف لتحليل المذنبات.
ويمكن بعد ذلك تفسير مدة واتجاه المسافة للمذنبات من حيث اتجاه وديناميات microtubule. توجهي الحرج وديناميات هي العوامل الرئيسية للعمليات الخلوية المدنية مثل تقسيم الخلية والهجرة وصيانة العمارة الخلوية. على الرغم من أن هناك العديد من الأدوات المتاحة لقياس ديناميات microtubule في قياس الجسم الحي يمكن أن يكون تحديا.
Autoflorescence، سمية الصورة، على قطعة أثرية التعبير، وكثافة متغير المبلغ عنها هي بعض الصعوبات التي واجهتها أثناء المراقبة الحية للبروتينات ملزمة نهاية، لتقييم ديناميات microtubule. باستخدام معدل وراثيا متكامل مع تركيز منخفض من الحمض النووي المرحل والتصوير الإضاءة المنخفضة، وقد تناولت هذه الدراسة أساليب للتخفيف من بعض هذه التحديات. يمكن توسيع وحدات التصوير والتحليل الموصوفة هنا لتشمل المراسلين الآخرين القائمين على microtubule ونقل البروتين.
هذا لا ينطبق فقط على الخلايا العصبية C.elegance، ولكن يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى وأنظمة النموذج.
