استخراج _F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

يلعب العامل المساعد F420 دورا مهما في عملية التمثيل الغذائي الأولي والثانوي للعديد من البروكاريوت. إن قياس هذا الجزيء في العينات البيئية يمكن من فهم أعمق لانتشاره ووظيفته. هذه التقنية تمكن من تحليل عامل المساعدة في مواد العينة الصعبة مثل الحمأة والتربة.

وبالتالي فإن تحلل المواد والتنقية قبل التحليل هي الخطوات المركزية. يتضمن البروتوكول خطوات مختلفة أثناء إعداد العينة. يجب تخطيط هذه الخطوات وإعدادها بشكل جيد جدا قبل البدء في معالجة العينة.

على سبيل المثال، إعداد مخازن جديدة مهم. لبدء تحلل العينة، ضع خمسة غرامات من العينة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم أضف خمسة ملليلترات من العازلة تحلل 2X إلى العينات، وبذلك حجم إلى 10 ملليلتر مع الماء المقطر للوصول إلى تركيز النهائي من 0.5 غرام لكل ملليلتر.

دوامة العينات المخففة لمدة 20 ثانية تليها الالاستعباد التلقائي لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية. لعينات جافة مثل التربة الحرجية، وتقديم إلى حجم النهائي من 20 ملليلتر مع الماء المقطر بعد الالاستعباد التلقائي، ودوامة العينة المخففة مرة أخرى لمدة 20 ثانية كما هو موضح. بمجرد أن تبرد العينات ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بتنحية العينة لمدة خمس دقائق عند 11000 × غرام ، وجمع الناسخ الفائق.

إعداد استخراج المرحلة الصلبة خمسة ملليلتر أو العمود SPE مليئة 100 ملليغرام من ضعف أنيون مختلطة وضع البوليمرية تكييف مبادل أنيون مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول. ثم، equilibrate مبادل أنيون مع ثلاثة ملليلتر من الماء المقطر. تحميل ما يصل إلى تسعة ملليلترات من supernatant من lysate الطرد المركزي على العمود SPE.

غسل الشوائب من العمود مع خمسة ملليلترات من خلات الأمونيا 25 ملليمولار وخمسة ملليلترات من الميثانول. بعد الغسيل، elute F420 عامل مساعد مع ملليلتر واحد من العازلة elution. مسبقا الفرن إلى 40 درجة مئوية، وتعيين كاشف الفلورسينس إلى 420 نانومتر طول الموجة الانقراض و470 نانومتر الطول الموجي للانبعاثات.

بعد ذلك، قم بتصفية العينة التي تم تحريرها من SPE إلى قوارير HPLC باستخدام فلتر PTFE بحجم مسام 0.22 ميكرون. حقن 50 ميكرولتر من العينة المصفاة في نظام HPLC، وفصل F420 المساعد عبر وضع التدرج باستخدام مزيج من مراحل المحمول كما هو موضح في المخطوطة. تحليل تكوين F420 مساعد والتركيز.

تم التحقق من نمو الثقافات النقية من الميثانوجينات عن طريق المجهر. في المجهر النقيض من المرحلة ، تكون مجمرات الميثانوجين مرئية ، والتي تنبعث منها ضوء مزرق عندما يكون العامل المساعد F420 متحمسا للأشعة فوق البنفسجية. تم تحليل منطقة الذروة من F420 مساعد تعافى بعد SPE مع كميات مختلفة من الثقافات الحرارية ميتانوكوليوس.

حققت استراتيجية التفكك الذاتي أعلى منطقة ذروة ، وخلصت إلى أقصى قدر من كفاءة الاستخراج باستخدام علاج درجة حرارة الضغط. وكشف تحليل توزيع طول الذيل عن الاختلافات في التركيز الكلي للمتبرع المساعد F420 وتوزيع طول ذيل F420 للثقافات الميثانوجينية النقية في العينات البيئية. عند تطبيق هذا الإجراء، يجب أن تكون على علم بتجميع إجمالي حجم المخزن المؤقت elution بالكامل أو تسجيل الحجم الدقيق للتدفق عبر.

تمهد هذه التقنية الطريق لاستكشاف F420 العامل المساعد في عينات أكثر تعقيدا مثل التربة والحمأة وتمكن من رؤى أعمق في التأثير البيئي لهذا الجزيء.