ولا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية السبب الأول للوفاة في جميع أنحاء العالم. تعتمد النماذج التقليدية في المختبر على ثقافة الطبقة الأحادية. ومع ذلك ، فإن القلب ، وتحديدا عضلة القلب أو عضلة القلب ، معقد في تركيبته ثلاثية الأبعاد والخليوية.
لذلك ، من المهم تحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل النماذج المختبرية لمحاكاة كل من المكونات الخلوية وبنية عضلة القلب بشكل أفضل. هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير الخلايا الجذعية الناضجة 3D المستمدة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic رواية. يتضمن هذا الجهاز قناة نسيج رئيسي ثلاثي الأبعاد مع أعمدة صغيرة بيضاوية فطرية تحفز درجات عالية من محاذاة خلايا القلب المغلفة الهيدروجيل المحيطة.
ويحيط القناة الرئيسية من قبل قنوات وسائل الإعلام مع منافذ الحقن التي تمكن من نشر المواد الغذائية في جميع أنحاء الأنسجة. نظرا للرعاية المطلوبة في التعامل مع الأجهزة الدقيقة ، فإن التمثيل البصري لهذا البروتوكول مفيد لإنشاء أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد بشكل صحيح داخل جهاز ميكروفلويدي مع أعمدة صغيرة مضمنة لتعزيز محاذاة الأنسجة. ينفصم الورم الليفي القلب البشري، أولا إخراج قارورة من الحاضنة.
وضع داخل خزانة السلامة الحيوية والبدء في يستنشق وسائل الإعلام المستهلكة من القارورة. ثم تأخذ ثلاثة MLs من برنامج تلفزيوني 1X لغسل القارورة. إغلاق الغطاء ودوامة القارورة بحيث يتم المغلفة بشكل صحيح أسفل في برنامج تلفزيوني.
يستنشق برنامج تلفزيوني. تأخذ ثلاثة MLs من 37 درجة تريبسين وإضافة إلى قارورة. ثم إمالة القارورة ودوامة بحيث يتم المغلفة تماما الجزء السفلي.
ثم ضع في الحاضنة لمدة أربع إلى ست دقائق. تحييد التريبسين مع تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية3 عن طريق اتخاذ ثلاثة MLs وإضافة ذلك إلى قارورة. Pipette الحل صعودا وهبوطا لطرد أي الخلايا التي تبقى على الجزء الخلفي من القارورة.
جمع تعليق الخلية في أنبوب فالكون 15 مل. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لحساب الخلايا بالمجهر. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 G لمدة أربع دقائق.
بعد الطرد المركزي، يستنشق supernatant الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية مع تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الطازجة3 لجعل المطلوب 75 مليون خلية لكل تعليق ML. إعادة تشغيل الخلايا، ثم تعيين أنبوب أسفل مع غطاء المجهزة فضفاضة.
لتفكيك خلايا القلب، أخرج الطبق من الحاضنة ونسخ وسائل الإعلام. خذ ستة MLs من برنامج تلفزيوني وغسل الآبار بحيث يكون هناك ML واحد من برنامج تلفزيوني في كل بئر. يستنشق برنامج تلفزيوني ، مع الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا المرفقة لوحة.
إضافة ستة MLs من trypLE اكسبرس الدافئة بحيث يكون هناك ML واحد في كل بئر من لوحة بئر ستة. احتضان الخلايا مع trypLE لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق، قم بتحييد المحاولة باستخدام ستة مل من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين بحيث تضيف مل واحد من RMPI إلى كل بئر.
استخدام واحد ماصة ML لجمع الحل والانفجار ضد ظهور الآبار لضمان رفع جميع الخلايا قبالة. جمع تعليق الخلية في أنبوب فالكون 15 مل. طرد مركزي الأنبوب في 300 G لمدة ثلاث دقائق.
بعد الطرد المركزي، يستنشق وسائل الإعلام و trypLE. هذه الخطوة مهمة لغسل خلايا القلب الحساسة. هذه الخطوة تضمن أن يذهب كل trypLE في تشكيل الأنسجة القلبية 3D.
Resuspend بيليه الخلية في خمسة MLs من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين. استخدام ماصة ML واحد ماصة الحل صعودا وهبوطا لضمان تعليق الخلية متجانسة. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية للعد مع مقياس الدم.
طرد الخلايا في 300 G لمدة ثلاث دقائق. يستنشق وسائل الإعلام بعد الطرد المركزي للمرة الثانية. إضافة الكمية المناسبة من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين لتحقيق 75 مليون خلية لكل تعليق ML، ثم إعادة الإنفاق.
لإعداد محلول الكولاجين للتغليف، لديك كل الكواشف على صندوق الثلج في غطاء محرك السيارة. ثم تأخذ 75 ميكرولتر من الكولاجين الأسهم. الكولاجين لزج جدا ، امتصاص ببطء مع ماصة ، ثم الاستغناء في أنبوب الطرد الدقيق على الجليد.
خذ 13.85 ميكرولتر من RPMI وأضف إلى الكولاجين في أنبوب فالكون. ثم تأخذ 10 ميكرولتر من الفينول الأحمر وإضافة إلى الخليط على الجليد وإعادة الإنفاق. وأخيرا، تأخذ 1.15 ميكرولتر من NaOH طبيعي واحد وإضافة إلى تعليق لتحييد.
ثم تأخذ 200 ميكرولتر ماصة تلميح وإعادة تعليق. الخطوة التالية هي تغليف الخلايا داخل ميتروجيل الكولاجين. ثم تأخذ aliquot من ثمانية ميكرولتر من CMs وإضافة إلى أنبوب فالكون الطازجة على الجليد.
ثم تأخذ اثنين من ميكرولتر من CS وإضافة إلى خليط الخلية. Resuspend تعليق الخلية والاستيلاء على 5.6 ميكرولتر من تعليق الخلية ووضعها في أنبوب فالكون الطازجة. ثم الاستيلاء على الكولاجين التي قمت بإعدادها للتو، واتخاذ أربعة ميكرولتر من الكولاجين، ثم تأخذ 2.4 ميكرولتر من المتروجيل.
ماصة الخليط صعودا وهبوطا لضمان توزيع متجانسة للتعليق هيدروجيل الخلية. بمجرد إعداد حقن الجل ، يمكنك إدخاله في الأجهزة. خذ نصيحة جديدة وا resuspend.
خذ طبق بيتري من الأجهزة، وأدخل الطرف في منفذ الحقن، وحقن ببطء وثبات. سترى قناة الجهاز تملأ مع تعليق هيدروجيل الخلية. بمجرد تعبئة المنفذ الآخر، توقف عن الحقن وأزل الطرف.
بعد الحقن، قم بقلب الأجهزة بالملاقط ووضعها داخل طبق بيتري الأكبر مع الماء في الحاضنة لمدة تسع دقائق. بعد تسع دقائق، أخرج الأجهزة من الحاضنة وانقلب منتصبا، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة تسع دقائق أخرى لإكمال بلمرة الهيدروجيل. الآن حان الوقت لإضافة وسائل الإعلام.
لذا، خذ RMPI زائد B27 وأدخل الطرف في منفذ الوسائط وابدأ بالدفع ببطء. ثم قم بذلك على منفذ الوسائط المقابل. قد تجد أن وسائل الإعلام لا يتم حقن، حتى تتمكن من وضع قطرة من وسائل الإعلام على رأس الميناء ومن ثم اتخاذ ماصة واستخدام الضغط السلبي لسحب وسائل الإعلام من خلال من الجانب الآخر.
لذلك سترى وسائل الإعلام يبدأ في الحصول على سحبها من خلال القناة. وبمجرد إضافة وسائل الإعلام إلى جميع القنوات الإعلامية، سيتم إعادة الأجهزة إلى الحاضنة عند 37 درجة. يظهر الجهاز microfluidic في الزاوية اليسرى العليا.
تظهر هذه الصورة في الأيام الأولى والسابعة وال14 للثقافة. بعد 14 يوما من الثقافة ، يجب أن تتكثف الخلايا في هياكل عالية المحاذاة تتشكل حول الأعمدة الدقيقة. تظهر آثار اليوم 14 هنا في C من الانكماش التلقائي ، وكذلك الصور المناعية للأنسجة الملطخة بال أكتين وعلامة القلب.
ما ينبغي أن ينظر إليه هو ألياف أكتين الانحياز للغاية التي تشكل بعد 14 يوما في الثقافة، فضلا عن ساركوميرس ناضجة المخططة موازية وتقاطعات الفجوة المترجمة. خلال هذا الإجراء، من المهم جدا الحفاظ على جميع المواد في درجات حرارة منخفضة على الجليد أثناء حقن هيدروجيل الخلية لمنع البلمرة المبكرة. يجب التعامل مع الأجهزة الدقيقة مع الرعاية ، سواء أثناء التصنيع ، والحقن ، وزراعة الأنسجة الممتدة.
يجب أن تكون حقن الخلايا عملية ثابتة لضمان ملء القناة بأكملها أثناء تنفيذها بسرعة لمنع البلمرة المبكرة أو جفاف الهيدروجيل قبل إضافة الوسائط.
