يمكن أن يساعد هذا البروتوكول العلماء المهتمين بدراسة الوظيفة الجزيئية للخلايا النجمية البشرية في مكانتها الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل وإثراء نوع معين من الخلايا ، الخلايا النجمية البالغة من عينات أنسجة المخ البشرية السائبة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور. يمكن تطبيق هذه المنهجية على عزل أنواع الخلايا الأخرى عن القشرة المخية الجديدة البشرية ، مثل الخلايا العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن باستخدام أجسام مضادة أخرى مترافقة مع الفلورسنت.
ابدأ في تشريح ما يقرب من 200 إلى 400 ملليغرام من الأنسجة من عينة أنسجة قشرة بشرية مجمدة جديدة. ضع المنديل في دزاز مناديل زجاجية سعة سبعة ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلترات من المخزن المؤقت للتحلل البارد على الجليد وطحن الأنسجة حوالي 50 مرة. انقل المتجانس إلى أنبوب بولي بروبيلين فائق الطرد المركزي سعة 12 ملليلتر.
استخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لإضافة 6.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للسكروز البارد إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي الفائق دون إزعاج الواجهة بين السكروز وتجانس الأنسجة. لجمع النوى ، قم بالطرد المركزي الفائق للليزات لمدة ساعة واحدة عند 101،814 مرة G وقم بشفط السوبرنات والحطام بعناية دون إزعاج الكرية. أضف 0.1٪ BSA في PBS إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق لحضانة لمدة 10 دقائق على الجليد قبل إعادة تعليق حبيبات النوى.
بعد ذلك ، استخدم التربان الأزرق لتصور النوى السليمة تحت المجهر الضوئي وللتأكد من أن التركيز أعلى من 10 إلى النوى الخامسة لكل ملليلتر للفرز المنشط بالتألق للنوى المعزولة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من العينة المعاد تعليقها إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على Alexa fluor 555 من الأجسام المضادة المضادة للفأر المترافق مع NeuN. أضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من العينة المعاد تعليقها إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على أجسام مضادة للماوس المترافق مع APC PAX6. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع الاهتزاز ، محمية من الضوء ، أضف DAPI بنسبة 1: 1000 إلى جميع العينات والضوابط.
لتضمين نوى ذات حجم مناسب واستبعاد خلايا الدم الحمراء والحطام ، استخدم أنبوب تحكم لبوابة الخلايا من مناطق تشتتها الأمامية والجانبية. لتحديد مجموعة النوى المفردة، قم بالبوابة حسب منطقة التشتت الأمامي مقابل عرض أو ارتفاع التشتت الأمامي ومنطقة التشتت الجانبي مقابل عرض أو ارتفاع التشتت الجانبي. بوابة من قبل DAPI لتشمل فقط النوى السليمة المفردة واستبعاد أي حطام ومزدوجات.
بعد وضع البوابة وفقا لأي عناصر تحكم إضافية في التألق، قم بتشغيل عينة التحكم DAPI فقط. قم بتشغيل عنصر التحكم NeuN Alexa fluor 555 فقط لتحديد قطع التلطيخ الإيجابي NeuN في قناة Alexa fluor 555. قم بتشغيل عنصر تحكم PAX6 APC فقط لتحديد قطع التلطيخ الإيجابي PAX6 في قناة APC.
بعد تشغيل جميع عناصر التحكم ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية NeuN لجمع الخلايا العصبية وبوابة الخلايا الإيجابية PAX6 مع السكان السالبين NeuN لجمع الخلايا النجمية. قم ببوابة وجمع أي مجموعات دبقية إضافية ذات أهمية من السكان السالبين PAX6 من NeuN. لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة السائبة ، بعد جمع 50،000 إلى 500،000 نواة في PBS المكمل بنسبة 0.04٪ BSA ، أضف ملليلترين من محلول السكروز ، و 50 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي الواحد ، و 30 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم ذات المولي الواحد إلى العينة.
اجعل الحجم النهائي للتعليق يصل إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS. امزج محتويات الأنبوب عن طريق الانعكاس واحتضن التفاعل على الجليد لمدة 15 دقيقة. قم بتكسير النوى عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق النوى في ملليلتر واحد من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي.
ثم ، دوامة الأنبوب ، وتجميد العينة على الجليد الجاف ، وتخزين النوى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتسلسل الكروماتين المقبول للترانسبوزاز أحادي النواة السائبة ، قم بجمع 50،000 إلى 75،000 نواة في PBS مكمل بنسبة 0.04٪ BSA في أنبوب طرد مركزي دقيق مغلف ب 5٪ BSA وتجميد النوى حتى تحليلها في المصب. يمكن فرز مجموعات النوى السلفية العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن من عينة جديدة من القشرة المخية الجديدة الصدغية البشرية المجمدة بعد الوفاة كما هو موضح.
أعطت دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة مزيدا من الأولوية ل PAX6 كعامل نسخ نووي أعلى يتم التعبير عنه بشكل تفاضلي عبر كل من المجموعات الفرعية للخلايا النجمية البالغة البروتوبلازمية والليفية. بعد الفرز ، يمكن وصف تغييرات النسخ الخاصة بنوع الخلية في القشرة المخية الجديدة للصرع المرضي الأساسي. في هذا التحليل ، أكدت التحليلات النسخية أن المجموعات السكانية الإيجابية ل NeuN إيجابية PAX6 تم إثراؤها بقوة لعلامات الخلايا النجمية واستنفدت للعلامات العصبية.
يمكن استخدام تلطيخ التألق المناعي لتأكيد التوطين المشترك ل PAX6 مع البروتين الحمضي الليفي الدبقي في الخلايا النجمية القشرية البشرية. ترتبط فترات ما بعد الوفاة الأقصر باستعادة أكبر للنوى السليمة من عينات الأنسجة الطازجة. يمكن استرداد غلة عالية من النوى السليمة من الأنسجة المجمدة حتى 24 ساعة بعد الوفاة ، ولكن في 30 ساعة ، يمكن استرداد عدد قليل جدا من النوى السليمة.
أهم شيء يجب تذكره هو الحصول على السكان الإيجابيين PAX6 من السكان السلبيين ل NeuN ، لأن هناك خلايا عصبية تعبر أيضا عن PAX6 ، ونريد استبعاد تلك. سمحت هذه التقنية أيضا بدراسة الخلايا النجمية في عينات الدماغ الجراحية للصرع ، مما زاد من توضيح عدم التنظيم الجزيئي للخلايا النجمية البشرية في سياق مكانة مرضية محددة.
