تقدم هذه الدراسة سير عمل جديد للكشف عن السارس-CoV-2 على الأسطح التي نادرا ما يتم تنظيفها في البيئة الحضرية، مثل مقابض مضخات الغاز والملاعب وأجهزة الصراف الآلي. وفي حالة الجائحة، تندر الإمدادات. نحن نستخدم مواد وأجهزة ومعدات يمكن الحصول عليها بسهولة في البيئات المختبرية الأساسية.
نحن نستخدم طريقة استخراج تحافظ على الحمض النووي الريبي دون سلسلة باردة ، وطريقة اكتشاف مقاومة للمثبطات. وهذا البروتوكول يخدم مصلحة الصحة العامة. وهو يوفر إطارا لتقييم الخزانات الفيروسية البيئية لوباء COVID-19 الحالي وغيره من العوامل المعدية خلال الفاشيات العالمية في المستقبل.
توظيف العلماء المواطنين باستخدام دعوة مباشرة وواضحة للعمل تم إصدارها عبر وسائل الإعلام المحلية والاجتماعية. إنشاء مقبض وسائل الاعلام الاجتماعية لربط الموضوع عبر محتوى وسائل الاعلام الاجتماعية. إنشاء رابط إلى SMP ، وتوفير المكونات متعددة اللغات لتمكين الملاحة بلغات متعددة للأفراد للتقدم بطلب للمشاركة في جهود أخذ العينات البيئية من خلال الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالسلامة البيولوجية المحددة في نموذج عبر الإنترنت.
تضمين في قسم أخذ العينات الرسم والبروتوكولات السمعية والبصرية باللغتين الإنجليزية والإسبانية. تصور البيانات الجغرافية المكانية باستخدام واجهة برمجة التطبيقات الجغرافية المكانية التي يسهلها مزود خدمة الكمبيوتر السحابي. تخزين البيانات المقدمة إلى نظام إدارة المعلومات من خلال SMP لتسهيل التخزين المركزي وتتبع سير العمل المعالجة وإدارة الخدمات اللوجستية.
معلومات التحميل المسبق مثل معرف مجموعة العينات، معرف العينة، التاريخ، الوقت، وإحداثيات نظام تحديد المواقع العمومي لتمكين التوافق مع نوع البيانات وتقليل الخطأ. قم بتضمين رابط طلب استلام عينة للمشاركين، والذي يمكنهم استخدامه بمجرد جمع جميع العينات. بناء مجموعة تحتوي على جميع لوازم أخذ العينات، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية اللازمة، مثل القناع والقفازات، وبروتوكول أخذ العينات، والمعلومات ذات الصلة بالسلامة البيولوجية.
نادرا ما كانت المسحة تطهر الأسطح في الأسر والبيئة الحضرية عن طريق ترطيب مسحة ماصة من البوليستر مربع سنتيمتر واحد بمنظف ومسح سطح مساحته 10 سنتيمترات مربعة. بمساعدة مسواك، غمر كل مسحة عينة في أنبوب المسمى مسبقا تحتوي على 200 ميكرولتر من ثيوسيانات جوانيدينيوم. ارتداء قناع المقدمة وزوج جديد من القفازات لجمع كل عينة لتجنب التلوث المتبادل.
بعد الانتهاء من أخذ العينات، استخدم مطهر اليد المقدم. تخزين الأنابيب في أربع درجات مئوية حتى يتم نقلها إلى المختبر. بمجرد وصول العينات إلى المختبر، قم بتخزينها عند درجة حرارة ناقصة 80 درجة مئوية.
لزيادة سرعة الفحص، قم بمعالجة العينات في المسابح. إذا كان تجمع إيجابي، استخراج الحمض النووي الريبي من كل عينة بشكل مستقل. الجمع بين العينات من كل مجموعة أخذ العينات في اثنين من برك عن طريق تجميع 50 ميكرولتر من كل من العينات الثمانية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وحفظ العينات المتبقية في ناقص 80 درجة مئوية.
إضافة 80 ميكرولتر من الكلوروفورم ودوامة لمدة 15 ثانية. ثم تحتضن لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. جهاز الطرد المركزي في 13، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.
نقل طبقة مائي في أنبوب جديد للطرد المركزي. تخزين الواجهة المتبقية والسائل الوردي في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. هذه الكسور تحتوي على الحمض النووي والبروتينات.
استخراج الحمض النووي الريبي من الطبقة المائية المستردة باستخدام بروتوكول استخراج خام الحمض النووي الريبي القائم على جوانيدينيوم ثيوسيانات. قم بإعداد مزيج رد فعل RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة مع حجم زائد بنسبة 10٪ لحساب فقدان الأنابيب. إضافة خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي إلى رد فعل العينة وخمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي بالإضافة إلى 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية سارس-CoV-2 إلى رد الفعل ارتفعت.
إضافة 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية سارس-CoV-2 إلى السيطرة الإيجابية وخمسة ميكرولترات من المياه إلى السيطرة السلبية. تخلط جيدا وتدور أسفل ردود الفعل. بالنسبة لمراقبة الألوان، يشار إلى النتيجة السلبية باللون الوردي ويشار إلى نتيجة إيجابية باللون الأصفر.
بعد RT-مصباح، إجراء إلكتروفورسيس هلام. يتم عرض توزيع مواقع جمع العينات هنا. وقد اكتملت معظم مجموعات المواد، وحملت البيانات المقابلة إلى النظام.
وكان الحد الأقصى للكشف على تردد 100٪ 500 نسخة لكل 25 ميكرولتر من التفاعل. في COLORImetric RT-LAMP، تغيرت العينات الإيجابية اللون من الوردي إلى الأصفر بسبب تحول رقم الحموضة من ثمانية إلى 5.5. في أرقام النسخ المنخفضة ، تم تشغيل العينات على هلام agarose لتأكيد الإيجابيات مع نمط يشبه السلم الناتج.
تم اختبار أساليب RT QPCR مع عينات بيئية. كانت جميع الخلطات الرئيسية حساسة للمثبطات بتركيزات عدد النسخ المنخفضة للتحكم الإيجابي. في تركيزات منخفضة من القالب، أظهرت أساليب RT PCR التقليدية إيجابيات كاذبة وسلبيات كاذبة.
وأخيرا، كشفت تقنية تسمى تضخيم الدائرة الدوارة عن كميات صغيرة من التسلسل المستهدف. ومع ذلك ، فإنه أظهر تضخيم التحقيق في غياب قالب الجيش الملكي النيبالي. ومن الأهمية بمكان إطلاق نداء للعمل يصل إلى جميع قطاعات المجتمع المحلي بحيث تمثل العينة حقا خطر تعرض جميع أفراد ذلك المجتمع.
يكشف هذا الإطار عن المادة الوراثية سارس-CoV-2. الدراسات لاختبار الجدوى الفيروسية هي الخطوة التالية.
