لا توجد منصة لتصوير مستقبلات المستضدات الخيمرية تم التحقق منها سريريا حتى الآن. يمثل سيمبورتر يوديد الصوديوم مراسلا حساسا وذا صلة سريريا لتصوير خلايا السيارة التائية بواسطة فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني TLP يسمح للخلايا التائية NIS CAR للمحققين بتتبع الخلايا المشبعة في الجسم الحي بشكل غير جراحي ولديه القدرة على التنبؤ بفعالية وسمية العلاج بالخلايا التائية CAR.
يتيح التصوير الفعال للخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول بسيطة ويمكن تطبيقها على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك الموضحة في هذه الدراسة. ابدأ بعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة أو PBMCs عن عينة الدم باستخدام تقنية تدرج الكثافة القياسية.
للقيام بذلك ، أضف بلطف 15 ملليلتر من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فصل تدرج الكثافة 50 ملليلتر لتجنب تكوين الفقاعة. لتجنب حبس الخلايا ، قم بتخفيف عينة الدم باستخدام PBS التي تحتوي على 2٪ FBS بنسبة حجم واحد إلى واحد ونقل الدم المخفف بلطف فوق وسط تدرج الكثافة دون كسر الواجهة بين الاثنين. ثم الطرد المركزي لأنبوب الفصل في 1،200 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
اجمع السوبرناتانت في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر ، واغسل الخلايا باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS عن طريق ملء الأنبوب حتى علامة 50 ملليلتر ، والطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط supernatant قبل تعليق الخلايا الكروية في 50 ملليلتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS. أعد تعليق PBMCs الحبيبية في PBS التي تحتوي على 2٪ FBS إلى تركيز 50 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر.
كرر الغسيل في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر. احسب عدد الخلايا ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. لعزل الخلايا التائية، انقل PBMCs المعزولة إلى أنبوب سفلي دائري من البوليسترين سعة 14 ملليلتر.
ثم استخدم مجموعة خرزة مغناطيسية ذات اختيار سلبي لإجراء عزل الخلايا التائية عن طريق وضع PBMCs في كوكتيل الأجسام المضادة ذات الاختيار السلبي في فاصل خلايا مؤتمت بالكامل. بعد عزل الخلايا التائية ، عد الخلايا وزرع الخلايا في وسط توسع الخلايا التائية أو TCM بتركيز اثنين من 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. بعد ذلك ، امزج القارورة التي تحتوي على الخرز المضاد ل CD3 / CD28 عن طريق الدوران وماصة الحجم المطلوب من الخرز في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر.
للغسيل ، أعد تعليق الخرز في ملليلتر واحد من TCM قبل وضع أنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وشفط supernatant. بعد إزالة الأنبوب من المغناطيس ، أعد تعليق الخرز المغسول في ملليلتر واحد من TCM وكرر الغسيل مرتين. أعد تعليق الخرز المغسول في ملليلتر واحد من TCM لنقلها إلى مزرعة الخلايا التائية ، ثم قم بتخفيف تعليق حبة الخلايا التائية باستخدام TCM إلى تركيز 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر قبل نقلها إلى مزرعة أنسجة معالجة بستة أطباق.
احتضان صفيحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للتقدم في نقل فيروسات lentivirus ، قم بإذابة فيروسات lentivirus المجمدة في طلاء مستقبلات مستضدات خيمرية أو سيمبورتر يوديد الصوديوم عند أربع درجات مئوية. بعد 24 إلى 48 ساعة من تحفيز الخلايا التائية ، امزج الخلايا التائية لتفتيت المجموعات وإضافة الفيروس اللئيم حديثا إلى الخلايا عند تعدد العدوى من خمسة.
احتضان الخلايا التائية المحولة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في الأيام الثالث والرابع والخامس من الحضانة ، قم بحساب الخلايا التائية المحولة وضبط تركيز الخلية إلى 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر عن طريق إضافة TCM طازج تم تسخينه مسبقا. بالنسبة للخلايا التائية المحولة من NIS التي تحمل جين مقاومة البيروميسين ، عالج الخلايا بميكروغرام واحد لكل ملليلتر من ثنائي هيدروكلوريد البيروميسين في الأيام الثالث والرابع والخامس.
في اليوم السادس ، قم بتفكيك مجموعات الخلايا التائية وإزالة الخرز المضاد ل CD3 / CD28 من الخلايا التائية المحولة عن طريق وضع اللوحة على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة. ثم ضع الخلايا التي تم جمعها مرة أخرى في المزرعة بتركيز 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. اغسل أليكوت من مزرعة الخلايا التائية التي تحتوي على 50،000 خلية مع مخزن مؤقت للتدفق وأعد تعليق الخلايا مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق.
للكشف عن تعبير CAR ، قم بتلطيخ الخلايا التائية بميكرولتر واحد من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للفئران. لاستبعاد الخلايا الميتة ، أضف 0.3 ميكرولتر من LIVE / DEAD Aqua. احتضان الخلايا الملطخة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
بعد 15 دقيقة ، اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق عند 650 مرة G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. لإصلاح الخلايا الملطخة واختراقها ، احتضن الخلايا ب 100 ميكرولتر من وسط التثبيت لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن مؤقت يحتوي على عامل نفاذ للخلايا مثل الصابونين وأجهزة الطرد المركزي.
بعد الغسيل ، أعد تعليق الخلايا المتخلل في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتغلغل. ثم أضف 0.3 نانوغرام من الأجسام المضادة المضادة ل ETNL NIS المضادة للإنسان واحتضنها عند أربع درجات مئوية. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، اغسل الخلايا بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح.
ثم احتضن الخلايا ب 50 ميكرولتر من مخزن التدفق العازل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الخلايا التائية كما هو موضح ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق لإجراء قياس التدفق الخلوي. ثم تحديد كفاءة نقل الخلايا.
في اليوم الثامن ، عد الخلايا التائية وقم بتدويرها بسرعة 300 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية قبل إعادة تعليق حبيبات الخلية بوسط تجميد بتركيز 10 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل قارورة تبريد ملصقة لتخزينها في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة ، انقل الخلايا التائية إلى النيتروجين السائل.
قم بإعداد الفئران التي تم حقنها بالخلايا التائية BCMA CAR الإيجابية من NIS للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب عن طريق وزن الفئران وإزالة علامات الأذن المعدنية. ثم حقن 9.25 ميغابيكريل من رباعي فلوروبورات F18 الطازج في الفأر عن طريق الوريد عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد 45 دقيقة من فترة الامتصاص ، تابع للحصول على صور PET ثابتة لفأر مخدر لمدة 15 دقيقة ، تليها الحصول على صورة CT لمدة خمس دقائق مع دوران 360 درجة و 180 إسقاطا.
في هذا التحليل التمثيلي، أدى النقل المشترك لفيروسين إلى خلايا T إلى توليد خلايا BCMA CAR T إيجابية ل NIS حيث كان أكثر من 90٪ من الخلايا إيجابية NIS. كشف تحليل حركية نمو الخلايا التائية من صفر إلى ثمانية أيام أن دمج BCMA CAR و NIS لم يؤثر بشكل كبير على توسع الخلايا التائية عند مقارنته بالخلايا غير المحولة. في تحليل التدفق الخلوي ل OPM-2 ، مثلت الخلايا المحولة بفيروس lentivirus تعبير GFP عند العلاج بالبوروميسين.
تعرضت الفئران التي تتلقى خلايا OPM-2 إيجابية BCMA لوسيفيراز إيجابية لتصوير التلألؤ الحيوي لتأكيد تطعيم خلايا OPM-2. كشف التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للفأر الذي يديره رباعي فلوروبورات F18 عن توزيع الخلايا التائية BCMA CAR الإيجابي ل NIS في مختلف الأعضاء ونخاع العظام. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت خلايا نخاع العظم التي تم حصادها من الفأر تطعيم خلايا OPM-2 وتوصيل الخلايا التائية BCMA CAR الإيجابية NIS إلى نخاع العظام.
للحصول على تصوير عالي الجودة للخلايا التائية CAR المغروسة ، من المهم اتباع خطوات بروتوكول توليد الخلايا التائية NIS CAR وتأكيد وجود كسور إيجابية مزدوجة NIS و CAR.
