باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا مراقبة انقسام الحمض النووي الخاص بالموقع مباشرة عن طريق تقييد نوكلياز الإندوكلياز على مستوى الجزيء الواحد. يسمح لنا نهجنا المتعدد الإرسال بقياس الوقت الذي تستغرقه مئات REases الفردية لإكمال الدورة الحفازة. يسمح لنا تعدد الإرسال بتوليد وقت مكوث مكوث مكتظ بالسكان لتوزيعات الانقسام التي يمكننا ملاءمتها مع توزيع احتمال جاما لاكتساب نظرة ثاقبة لآلية انقسام الحمض النووي.
ابدأ بإعداد أنبوب جديد لكل قليل النوكليوتيد المعاد تعليقه عند 50 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد و 50 ميكرولتر من محلول DTT المحضر حديثا لكل أنبوب ، ماصة لأعلى ولأسفل للخلط والحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة الحجم الكامل لكل خليط عينة برفق على عمود مجهز وأجهزة طرد مركزي عند 750 جيجا لمدة دقيقتين. بعد الطرد المركزي ، قم بتخزين أي عينات لن يتم استخدامها على الفور عند 20 درجة مئوية لمنع أكسدة مجموعات الثيول وتكوين روابط ثاني كبريتيد.
ماصة واحدة من 50 ميكرولتر من مخزون النقاط الكمومية في جهاز غسيل الكلى لكل بناء يتم إجراؤه ، مع التأكد من عدم لمس الغشاء بطرف الماصة. قم بغسيل الكلى مقابل حجم من المخزن المؤقت CHES لا يقل عن 1000 ضعف حجم العينة مع التحريك عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. باستخدام جهاز سحب ، استرجع بعناية النقاط الكمومية المعلقة من جهاز غسيل الكلى وانقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على حجم متساو من محلول Sulfo-SMCC المحضر حديثا ، مع سحب السحب لأعلى ولأسفل للخلط.
احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 1،000 دورة في الدقيقة للسماح ل Sulfo-SMCC بالتفاعل مع الأمينات الأولية على النقاط الكمومية. بعد ذلك ، استخدم جهاز سحب لنقل كل عينة بعناية إلى جهاز غسيل الكلى الجديد. لإزالة السلفو-SMCC الزائد، قم بغسيل الكلى مقابل حجم من المخزن المؤقت CHES لا يقل عن 1000 ضعف الحجم الموجود في جهاز غسيل الكلى مع التحريك لمدة 15 دقيقة.
استبدل المخزن المؤقت مرتين وقم بإجراء غسيل الكلى باستخدام محلول CHES الطازج ثلاث مرات في المجموع ، مما يسمح بإجراء غسيل الكلى لمدة 15 دقيقة بعد كل تبادل للمخزن المؤقت. ثم كرر غسيل الكلى مع برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة ، استرجع بعناية المحلول الذي يحتوي على النقاط الكمومية من جهاز غسيل الكلى وانقل كل عينة إلى أنبوب جديد يحتوي على كمية متساوية من قليل النوكليوتيد المتوسع المخفف في برنامج تلفزيوني.
احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عند 1،000 دورة في الدقيقة. أضف BSA إلى كل عينة للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 ملليجرام لكل ملليلتر. ثم استخدم جهاز سحب لنقل كل عينة بعناية إلى جهاز غسيل كلى جديد وغسيل الكلى مقابل المخزن المؤقت للتخزين.
بعد غسيل الكلى ، استرجع كل عينة بعناية وضعها في أنبوب جديد. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية. اجمع عينة من قليل النيوكليوتيدات المسمى بالنقاط الكمومية مع فائض مولي بمقدار عشرة أضعاف من قليل النوكليوتيد البيوتينيل.
سخني الخليط في كتلة حرارة إلى 75 درجة مئوية وامسكه عند درجة الحرارة هذه لمدة 5 دقائق. ثم أطفئ كتلة الحرارة واترك الخليط يبرد ببطء. قم بتخزين البناء المكتمل عند 4 درجات مئوية باستخدام أداة دوارة متعددة محمولة باليد مزودة بلقمة عجلة ماسية مدببة ، قم بحفر فتحتين في الزوايا المقابلة لشريحة الكوارتز لتكون بمثابة مدخل ومخرج.
تأكد من تثبيت الشريحة في مكانها ، وقم بتليين اللقمة والانزلاق باستمرار بالماء أثناء الحفر. بعد كل تجربة ، استرجع شريحة الكوارتز المحضرة عن طريق نقع الجهاز المستخدم في الأسيتون لإذابة المادة اللاصقة والإيبوكسي. تخلص من المكونات المتبقية.
الجمع بين 25 ميكرولتر من محلول streptavidin مع 80 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. قم بتغطية غطاء معالج ب PEG بهذا الخليط ، واحتضانه في بيئة رطبة لمدة 30 دقيقة. أثناء حضانة انزلاق الغطاء ، قم بإعداد فاصل التصوير لإنشاء قناة تدفق.
قم بقص قطعة مربعة بحجم 1 بوصة من مادة فاصل التصوير ، ثم حدد قناة بعرض 2 مم محاذاة إلى نهايات الثقوب المحفورة في شريحة الكوارتز. اقطع القناة من مادة الفاصل بمشرط. نظف شريحة الكوارتز جيدا باستخدام الأسيتون لإزالة أي بقايا لاصقة من التجارب السابقة.
قشر جانبا واحدا من الدعم من فاصل الصورة وضعه بعناية على شريحة الكوارتز ، مع الحرص على عدم تغطية فتحات المدخل والمخرج. اغسل غطاء الغطاء بالماء وجففه بالهواء المضغوط. قم بإزالة الجانب الآخر من الدعم من فاصل التصوير وقم بشطره بين شريحة الكوارتز وانزلاق الغطاء المطلي بالستربتافيدين الوظيفي باستخدام ملاقط بلاستيكية للضغط على المجموعة معا وإزالة فقاعات الهواء من المادة اللاصقة.
اقطع نهاية الأنبوب بزاوية لضمان التدفق الحر للمحلول. ثم أدخل أنبوب بولي إيثيلين بطول 30 سم في كل فتحة في شريحة الكوارتز. ثبت الأنابيب في مكانها باستخدام رف أنبوبي ، ثم استخدم الإيبوكسي لإغلاق الأنابيب في مكانها وحواف الجهاز المجمع.
بمجرد ضبط الإيبوكسي ، أدخل الإبرة الحادة على حقنة فارغة في أنبوب مخرج الجهاز واغمر نهاية أنبوب المدخل في حاوية مملوءة بالمخزن المؤقت للحظر. اسحب مكبس المحقنة لملء الجهاز بمخزن مؤقت للحظر. ثم اترك الجهاز لاحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
قم بتوصيل جهاز الموائع الدقيقة بلوحة مرحلة المجهر بشريط. اجعل الهدف على اتصال بالجزء السفلي من الجهاز وضع الهدف بحيث يكون مجال الرؤية داخل قناة الموائع الدقيقة. بعد توصيل أنبوب المخرج بمضخة المحقنة ، اغسل قناة الموائع الدقيقة بمخزن مؤقت جديد عن طريق سحب مكبس المحقنة.
تحقق للتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة في الأنبوب أو في القناة. تمييع 1 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي المحضرة إلى 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للحظر. ضع أنبوب المدخل في ركيزة الحمض النووي المخففة وتدفق 800 ميكرولتر من محلول الركيزة عبر القناة بمعدل 200 ميكرولتر في الدقيقة.
اسمح لمحلول الحمض النووي بالاحتضان في القناة لمدة 15 دقيقة بعد توقف التدفق. بعد الحضانة ، قم بتدفق ما لا يقل عن 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع عبر القناة بمعدل 200 ميكرولتر في الدقيقة لشطف الحمض النووي غير المرتبط خارج القناة. اضبط تركيز المجهر بحيث تكون النقاط الكمومية المربوطة بالسطح مرئية بوضوح.
اغسل جهاز الموائع الدقيقة ب 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت التجريبي بدون المغنيسيوم بمعدل تدفق 200 ميكرولتر في الدقيقة. أضف REase إلى حصة من المخزن المؤقت التجريبي بدون المغنيسيوم واخلطه برفق عن طريق الماصة. تدفق 800 ميكرولتر من 400 وحدة لكل ملليلتر من EcoRV عبر القناة بمعدل تدفق 200 ميكرولتر في الدقيقة.
ابدأ التجربة بتدفق المخزن المؤقت التجريبي الذي يحتوي على المغنيسيوم والفلوريسئين بمعدل تدفق 200 ميكرولتر في الدقيقة. ابدأ في التقاط البيانات فور بدء تشغيل مضخة المحقنة. توقف عن الحصول على البيانات بعد تدفق 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
بعد إدخال ركيزة الحمض النووي (DNA) في خلية السريان والتخلص من الحمض النووي الزائد والنقاط الكمومية، توجد عادة آلاف النقاط الكمومية الفردية في مجال الرؤية. يتم ربطها بثبات بالسطح الزجاجي ولا تخضع لتعتيم ملحوظ أو تبييض كبير طوال التجربة. عندما يتدفق REase عبر القناة في غياب المغنيسيوم ، لا يزال من الممكن رؤية 95٪ على الأقل من النقاط الكمومية الموجودة في بداية التجربة في نهاية فترة المراقبة.
ومع ذلك ، عندما يتم تدفق المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم مباشرة بعد REase ، يختفي ما يصل إلى نصف النقاط الكمومية بنهاية فترة المراقبة ، على غرار ما يتم ملاحظته عندما يتم تدفق REase والمغنيسيوم عبر القناة معا. يحدث اختفاء النقاط الكمومية بسرعة ويؤدي إلى انخفاض حاد في مسار الشدة ، مما يوفر مؤشرا واضحا على الوقت الذي يتم فيه شق جزيء الحمض النووي المعين. تم إجراء هذه التجربة باستخدام النوع الثاني P REase EcoRV المدروس جيدا.
تم استخدام كل من تركيب منحنى المربعات الصغرى غير الخطية وتقدير معلمة الاحتمال الأقصى لاستخراج قيم n وبيتا من البيانات. كانت طريقتا تقدير المعلمات متفقتين. باستخدام ملاءمة المربعات الصغرى غير الخطية ، كان n 3.52 وكان بيتا 5.78 ثانية.
باستخدام تقدير الاحتمال الأقصى ، كان n 3.41 وكان بيتا 6.06 ثانية. يمكن أن يوفر هذا الفحص دليلا على وجود خطوات وسيطة على طول مسار الانقسام. يمكن أن يساعد إجراء هذا الفحص في ظل ظروف التفاعل المتغيرة في تحديد طبيعة وسيطات التفاعل التي لا يمكن ملاحظتها مباشرة.
