إنشاء وصيانة بنك حيوي حي كيف نفعل ذلك. مقدمة. تحتوي البنوك الحيوية التقليدية عادة على عينات من الأنسجة والدم غير القابلة للحياة. على الرغم من انعكاس تنوع مجموعات مرضى السرطان بشكل كاف والسماح بالتحاليل الجينية والهسولوجية ، إلا أنها غير مناسبة لإجراء فحوصات ما قبل السريرية لتقييم الاستراتيجيات العلاجية.
ويتغلب البنك الحيوي الذي يدمج أيضا النماذج المشتقة من المريض على هذه القيود. وبالتالي تمكين الاختبار الوظيفي للطب الدقيق. الحصول على عينة.
لbiobanking من سرطان القولون والمستقيم والبنكرياس، وانتخاب الحالات مع تشخيص ثبت فضلا عن حجم الورم كافية، concent علم من المريض إلزامي. قبل بدء الجراحة، ارسم 20 مل من الدم باستخدام حقنة هبارينية و7.5 مل إضافية مع مونوفيت مصلي. معالجة المصل وعزل PBL.
بعد الطرد المركزي في 1، 128 RCF لمدة 15 دقيقة في أربع درجات يتم اقتباس المصل في cryotube المسمى مسبقا ومغمورة مباشرة في النيتروجين السائل. يتم نقل الدم الهيبارين إلى أنبوب البولي بروبلين وتمييعها مع برنامج تلفزيوني 15ml. استخدام ماصة المصلية لركيزة ببطء الخليط مع 15ml بانكول.
بعد الطرد المركزي الانحدار الكثافة، يتم تناول طبقة مبهمة تحتوي على الخلايا أحادية النووية مع ماصة المصلية ونقلها إلى أنبوب PP جديدة. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني والكريات الخلايا النووية الأحادية عن طريق الطرد المركزي، والتخلص من supernatant وإعادة إنفاق بيليه في الثلاجة المتوسطة والاستغناء في cryotubes المسمى مسبقا. نقل الأنابيب إلى حاوية التبريد مناسبة لبطء تجميد مع درجة واحدة في الدقيقة الواحدة وتخزين مؤقت في 80 درجة.
معالجة الأنسجة. بمجرد أن يتم استئصال عينة الأنسجة من قبل الجراح ، ضعها في وعاء مناسب. تجنب في جميع الظروف أن الأنسجة مغطاة بالفورماتين.
نقل أسرع وقت ممكن إلى علم الأمراض لاستئصال مادة الورم غير ذات الصلة للتقييم المرضي لهوامش استئصال. يجب التعامل مع قطعة الورم قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، الحصول على عينة من الأنسجة السليمة ووضع كليهما في أنابيب منفصلة مملوءة مسبقا بمحلول تخزين الأنسجة على الجليد.
العودة فورا إلى المختبر لبدء معالجة الأنسجة في ظل ظروف معقمة. يتم وضع قطعة الأنسجة على طبق بلاستيكي معقم مليء بمحلول تخزين الأنسجة لتجنب الجفاف. أولا وقبل كل شيء، مكوس قطعة واحدة أو أكثر من رأس الدبوس الحجم لتجميد المفاجئة اعتمادا على حجم عينة الأنسجة التي تم الحصول عليها.
ضع الأنسجة الأصلية في الأنابيب المبردة المسماة مسبقا وغمرها على الفور في النيتروجين السائل. قطع الأنسجة المتبقية إلى مكعبات من ثلاثة في ثلاثة في ثلاثة ملليمترات مكعبة. تأخذ في الاعتبار أنه يجب تشريح الأنسجة النخرية تماما ولكن لا ينبغي التخلص منها.
ترتيب مكعبات في رباعية لتحديد عدد aliquots لتخزين الحيوية. تسمية عدد كاف من cryotubes وقبل ملء لهم مع 1.5ml الفريزر المتوسطة لكل منهما. منذ DMSO في الثلاجة المتوسطة هو السامة للخلايا، وأداء الخطوات التالية بسرعة ودون انقطاع.
استخدم شفرات مشرط لاستخراج أربع قطع من الأنسجة لكل أنبوب. تأكد من أن جميع القطع مغمورة بالكامل في الفريزر المتوسط بشكل مثالي في الجزء السفلي من الأنبوب وتجميد الأنابيب بسرعة باستخدام حاوية التجميد. المضي قدما بنفس الطريقة مع عينة صحية.
للتخزين على المدى الطويل، وتخزين جميع aliquotes في خزان النيتروجين السائل. ثقافة الخلية. طحن بقايا معالجة أنسجة الورم، بما في ذلك الأجزاء النخرية مع شفرات مشرط صغيرة قدر الإمكان.
وضع مصفاة الخلية في الجزء العلوي من أنبوب PP العقيمة وتنشق التعليق مع ماصة المصلية لتمرير من خلال مصفاة الخلية. استخدام المكبس من حقنة استخدام واحد للضغط على الأنسجة يبقى من خلال مصفاة الخلية لتوليد تعليق خلية واحدة. شطف مع برنامج تلفزيوني وتكرار هذه الخطوات حتى لا يكون هناك أي مادة اليسار.
إزالة مصفاة الخلية والطرد المركزي تعليق في 180 RCF لمدة سبع دقائق. في غضون ذلك، إعداد الكولاجين المغلفة مسبقا ستة جيدا لوحة مع التراكيب وسائل الإعلام المختلفة لزيادة احتمال نمو الورم. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في برنامج تلفزيوني والاستغناء عن 500 ميكرولتر لكل بئر.
بعد ذلك، ضع اللوحة في حاضنة قياسية. جيل من xenograft المشتقة من المريض. بالنسبة لتوليد xenografts المشتقة من المريض في الفئران المنافرة المناعية ، يجب الاحتفاظ بالحيوانات في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض.
ارتداء معدات الحماية الشخصية التي تتألف من الدعك، مئزر، قناع الوجه، غطاء الشعر والقفازات. بعد ترتيب مساحة العمل الخاصة بك، واتخاذ عينة الورم الرغبة من حاوية النيتروجين السائل. ملء أنبوب PP جديدة مع برنامج تلفزيوني 35ml ثم غسل عملية ذوبان بعناية وإمالة أنبوب التبريد صعودا وهبوطا.
بمجرد أن يصبح المحتوى خشنا ، سكب في برنامج تلفزيوني وشطف قطع الورم. تجاهل غالبية برنامج تلفزيوني وتفريغ المكعبات في الغطاء. وضع طبق بلاستيكي معقم على كيس من الثلج وإضافة قطرة من 100 ميكرولتر Matrigel.
استخدام ملقط لوضع قطع الورم في Matrigel واحتضان الورم لمدة 10 دقائق. في غضون ذلك، تخدير اثنين من الفئران. تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص قدم الحيوان.
تشير أي حركة إلى عدم كفاية التخدير وتتطلب إما بعض الانتظار أو الخضوع لخضوع إضافي. تطبيق مرهم العين، قرصة الماوس من الرقبة وحقن رقاقة تحت الجلد. إجراء الخطوات التالية بالتوازي.
تطهير أجنحة الفئران وجعل شق الجلد الصغيرة مع مقص Metzenbaum شريط وتشكيل جيب تحت الجلد عن طريق إعداد حادة. استخدام ملقط التشريحية لإدراج قطع الورم. تأكد من وضع القطعة في الطرف الخلفي من جيب الجلد.
يستنشق ماتريغل المتبقية وتوزيعها بالتساوي على جميع الجيوب الأربعة. انتظر علاج الجل وإغلاق الجلد مع الغرز زر واحد دون الإضرار قطع الورم مع الإبرة. قطع الموضوع قصيرة قدر الإمكان فوق عقدة وتطبيق رذاذ خلع الملابس لمنع noying من الغرز.
مسح رقاقة وإضافة معلومات الورم إلى قاعدة البيانات لتحديد في وقت لاحق من الحيوان. إعداد قفص مع الفراش الطازج ومواد التعشيش، وضعت الفئران أمام مصباح الأشعة تحت الحمراء ورصد الحيوان حتى تهدأ التخدير. إزالة PDX.
بعد أن يصل ورم PDX إلى الحجم المطلوب ، يتم قتل الفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم اللاحق. تشريح بعناية الجلد من الورم وإزالة PDX تماما. النتائج التمثيلية.
ضع ورما على طبق بلاستيكي معقم واستخدم شفرات مشرط معقمة لمزيد من المعالجة. قطع حفرة مع شرائح، ووضعها في كاسيت الأنسجة وغمر في الفورماليين لتوليد عينة البارافين جزءا لا يتجزأ من التقييم النسيجي في وقت لاحق. نقل بقية الورم إلى محلول تخزين الأنسجة وخلق عينة جديدة محفوظة بشكل حيوي والمفاجئة المجمدة للبنك الحيوي.
بالإضافة إلى ذلك، استخدم بقايا الورم PDX مماثلة لثقافة الخلية الفصل لإنشاء خطوط خلايا الورم الثانوية. لتوليد المزيد من PDX، نقل قطعتين أو أكثر من الورم مع Matrigel إلى ماوس مستلم جديد كما هو موضح سابقا. استنتاج. من خلال البروتوكول المقدم، تمكنا حتى الآن من إنشاء تسعة خطوط خلايا سرطانية مشتقة من المريض من البنكرياس وأكثر من 100 خط خلايا سرطانية مشتقة من القولون والمستقيم، بالإضافة إلى 19 طرازا من البنكرياس وأكثر من 150 طرازا من طرازات PDX القولون والمستقيم.
