يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد وتوصيف العناصر التنظيمية التي تتحكم في الترجمة أثناء نضوج البويضات. طبقنا المجهر الفاصل الزمني لتقييم تراكم المراسل في جميع أنحاء نضوج البويضات في المختبر. هذا يحدد بدقة الوقت الذي يحدث فيه التنشيط أو القمع الترجمي أثناء نضوج البويضات.
للبدء، افتح بصيلات الأنترال بعناية عن طريق إجراء قطع صغير في جدار الجريب بإبرة قياس 26. عزل COCs سليمة مع عدة طبقات من خلايا الركاز باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم. استخدام ماصة أصغر وdenude ميكانيكيا COCs عن طريق الأنابيب المتكررة.
أسبيرات البويضات النضحة ووضعها في طبق بتري مع متوسطة النضج تكملها ميكرومولار واحد من السيلوستاميد. ضع الطبق في حاضنة لمدة ساعتين للسماح للبويضات بالشفاء من الإجهاد الناجم عن عزلتها عن الجريبات. ضع أنبوبا شعريا زجاجيا بطول 10 سنتيمترات في سحب ميكانيكي لإعداد إبر الحقن.
ثني طرف الإبرة بزاوية 45 درجة باستخدام خيوط ساخنة للحقن الأمثل. ضع 20 قطرة ميكرولتر من وسيط جمع البويضات الأساسي في طبق البوليسترين، وغط القطرات بالزيت المعدني الخفيف. إعداد حجم أكبر من مزيج المراسل بإضافة 12.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من Ypet UTR وmCherry لكل منهما.
تخزين aliquots من هذه في ناقص 80 درجة مئوية. عند ذوبان الجليد، والطرد المركزي وaliquot لمدة دقيقتين في 20، 000 مرة G، ثم نقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد. تحميل إبرة الحقن مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من مزيج المراسل.
وضع ماصة عقد وإبرة الحقن في أصحاب ووضعها في قطرة من البويضات جمع المتوسطة. فتح إبرة الحقن عن طريق التنصت بلطف ضد ماصة عقد. وضع البويضات في قطرة من مجموعة الأساسية المتوسطة وحقن خمسة إلى 10 picoliters من مزيج المراسل.
احتضان البويضات ونضج المتوسطة مع cilostamide واحد ميكرومولار لمدة 16 ساعة للسماح للإشارة mCherry إلى الهضبة. للفحص المجهري الفاصل زمنيا ، قم بإعداد طبق بيتري مع قطرتين من 20 ميكرولتر من وسيط النضج لكل مراسل تم حقنه ، قطرة واحدة مع سيلوستاميد ميكرومولار واحد للسيطرة على البويضات التي اعتقلتها I ، وقطرات واحدة بدون cilostamide للبويضات الناضجة. قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني الخفيف ووضعها في الحاضنة.
بعد مرحلة ما قبل الحضانة، قم بإزالة البويضات المحقونة من الحاضنة وغسلها أربع مرات في وسط النضج دون سيلوستاميد. الحفاظ على بعض البويضات في المتوسط النضج مع cilostamide الميكروفولار واحد كمجموعة مراقبة البويضات prophase الأول. نقل البويضات المحقونة إلى قطرات كل منها على طبق المجهر الفاصل الزمني المعد مسبقا.
الكتلة البويضات مع ماصة زجاجية مغلقة لمنع حركتهم أثناء التسجيل. ضع الطبق تحت المجهر المجهز بنظام إزالة الصمام الثنائي الباعث للضوء ومرحلة مزودة بمحرك مجهز بغرفة بيئية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، باستخدام المعلمات المذكورة في مخطوطة النص. أدخل الإعدادات المناسبة لتجربة الفاصل الزمني بالنقر فوق التطبيقات ثم اكتساب متعدد الأبعاد.
حدد علامة التبويب الرئيسية الأولى، وحدد الفاصل الزمني، ومواضع المراحل المتعددة، والأطوال الموجية المتعددة. حدد علامة التبويب حفظ لإدخال الموقع الذي يجب حفظ التجربة فيه. ثم حدد علامة التبويب الفاصل الزمني لإدخال عدد النقاط الزمنية والمدة والفاصل الزمني.
حدد مرحلة علامة التبويب، والتبديل على brightfield، وتحديد موضع البويضات عن طريق فتح نافذة جديدة وتحديد الحصول على، والحصول على، وإظهار لايف. مرة واحدة يتم تحديد موقع البويضات، والتحول مرة أخرى إلى نافذة اكتساب متعددة الأبعاد واضغط زائد لتعيين موقع البويضات. حدد علامات التبويب الأطوال الموجية وتعيين ثلاثة أطوال موجية مختلفة ل brightfield، YFP، و mCherry.
ضبط التعرض لYpet و mCherry ، ثم بدء تجربة الفاصل الزمني عن طريق النقر على اكتساب. لتحليل Ypet ثلاثة ترجمة UTR رئيس الوزراء، وإجراء قياسين المنطقة لكل البويضات، والبويضات نفسها عن طريق النقر على منطقة القطع الناقص، ومنطقة صغيرة المحيطة البويضات لاستخدامها للطرح الخلفية عن طريق النقر على منطقة مستطيلة. تصدير بيانات قياس المنطقة إلى جدول بيانات بالنقر فوق فتح سجل ثم تسجيل البيانات.
لكل بويضة فردية ولجميع النقاط الزمنية المقاسة، قم بطرح قياس منطقة الخلفية من قياس منطقة البويضات بشكل منفصل لأطوال الموجات YFP و mCherry. تم تسجيل التعبير عن mCherry و YFP في prophase I والبويضات الناضجة في 39 بويضة ، منها 30 نضجت ، وألقي القبض على تسعة في prophase I كسيطرة سلبية. تم تصحيح نسب YFP الفردية إلى mCherry لإشارات البروبهاز I-القبض على والبويضات الناضجة لحجم حقن بقسمة إشارة YFP على متوسط إشارة mCherry من النقاط الزمنية ال 10 الأخيرة ل prophase I-القبض والبويضات النضج.
تم قياس معدلات الترجمة لمراسل YFP من خلال منحنى المناسب نسب YFP إلى mCherry في prophase I وفي البويضات الناضجة خلال الصفر الأول إلى ساعتين ، أو ثماني إلى 10 ساعات بعد إطلاق cilostamide باستخدام الانحدار الخطي. لا يتبع تراكم المراسل نمطا خطيا ، كما هو مبين في الفرق الكبير في معدلات الترجمة بين صفر إلى ساعتين وثماني إلى عشر ساعات بعد إطلاق cilostamide ، مما يشير إلى تنشيط ترجمة interleukin 7 أثناء نضوج الخلايا النضحية. عند محاولة هذا البروتوكول، تأكد من أن وقت التعرض كاف في بداية التسجيل.
ضع في اعتبارك أن الإشارة قد تشبع أثناء الدورة الزمنية إذا تم تنشيط الترجمة أثناء استئناف البويضة الدموية. يمكن تأكيد استقرار MRMA بواسطة PCR، باستخدام التهيئة ل YFP. لتأكيد التغييرات في الترجمة، يمكنك استخدام النشاف الغربي مع الأجسام المضادة ضد تقنية V5.
