Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

وقد أمكن هذا العمل من خلال دعم الهياكل الأساسية التشغيلية لحكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS وبدعم من تمويل من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (ALW #1120300) ومجلس البحوث الأسترالي (KJH #FT190100265). ويود المؤلفون الاعتراف بالدعم التقني لمنصة موناش لأبحاث الحيوانات ومنصة موناش لعلم الأنسجة ومنشأة موناش للتصوير الدقيق.

تم جمع المبيضين من الفئران C57BL6J الإناث. تم إجراء جميع الإجراءات والتجارب الحيوانية وفقا لمدونة ممارسات NHMRC الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها ووافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان منصة موناش للأبحاث الحيوانية.
ملاحظة: تم استخدام عامل العلاج الكيميائي الذي ثبت أنه يستنفد البويضات البصيلة البدائية ، كما تم تحديده باستخدام الستيرولوجيا11 والتعداد المباشر12،13 في هذا التقرير لمقارنة طريقتي العد في نفس الحيوان. أنثى، 8 أسابيع من العمر (الشباب البالغين) الفئران كانت تزن قبل حقن واحد داخل الصفاق من 75 ملغ / كجم / وزن الجسم من السيكلوفوسفاميد، أو التحكم في السيارة المالحة (ن = 5/group). وقد ثبت أن هذه الجرعة تسبب استنفاد حوالي 50٪ من بصيلات البدائية، ولكن لم يبلغ عن تسبب المراضة أو الوفيات في الفئران14. تم حصاد المبيضين بعد 48 ساعة من العلاج. تم إصلاح مبيض واحد من كل في حل 10٪ (v/v) المحايد العازلة الفورمالين لمدة 24 ساعة، والآخر ثابت في حل بوين لمدة 24 ساعة. ثم تم تضمين الأنسجة إما في راتنج غليكولميثاكريلات وقسمت بشكل متسلسل في 20 ميكرومتر، أو في البارافين ومقسمة بشكل متسلسل في 5 ميكرومتر. كانت جميع الأنسجة ملطخة بالحمض الدوري شيف والهيماتوكسيلين.
1. إعداد النسيج: التثبيت والمعالجة والتضمين وتقسم مبايض الفئران
<ol><li>تشريح المبيضين الماوس عن طريق تقليم oviduct وجميع الدهون المحيطة بها، دون الإضرار أو قطع المبيض نفسه. إذا لزم الأمر، استخدم مجهر تشريح وشفرة دقيقة لهذه الخطوة(الشكل 1A).</li>
	<li>إصلاح الأنسجة على الفور عن طريق وضع في أنبوب صغير وصفت تحتوي إما على تثبيت بوين (مجسمة)، أو مثبتة الشكلية (التهم المباشرة) لمدة 24 ساعة(الشكل 1B)،قبل نقل الأنسجة إلى الإيثانول 70٪. ملاحظة: يتم الحفاظ على مورفولوجيا الجريبات بشكل أفضل داخل أنسجة المبيض الثابتة لبوان، المضمنة في راتنج غليكولميثاكريلات(الشكل 2).</li>
	<li>معالجة المبايض الثابتة بالكامل ثم تضمينها في راتنج غليكولميثاكريلات للجسم(ملف تكميلي 1)،أو شمع البارافين للتعداد المباشر باستخدام بروتوكول النسيج القياسي. تنبيه: الراتنج سام، لذا تأكد من تنفيذ جميع خطوات معالجة الأنسجة في غطاء الدخان ويتم ارتداء القفازات في جميع الأوقات.</li>
	<li>استخدام الراتنج المتخصصة ميثاكريلات ميكروتوم(الشكل 1C)مزودة سكين زجاجية (الشكل 1D) لقطع شامل سميكة glycolmethacrylate أقسام الراتنج (على سبيل المثال، 20 ميكرومتر). جمع المقاطع على فترات منتظمة (على سبيل المثال، كل قسم 3rd) على شرائح المجهر الزجاجي للجسم.</li>
	<li>استخدم ميكروتوم قياسي لقطع أجزاء البارافين الرقيقة (على سبيل المثال، 4-6 ميكرومتر). جمع أقسام الأنسجة على فترات منتظمة (على سبيل المثال، كل 9 القسم) علىشريحة المجهر الزجاجي لأعداد الجريبات المباشرة.</li>
	<li>وصمة عار الشرائح مع شيف حمض الدوري والهيماتوكسيلين (ملف التكميلية 2).</li>
	<li>Coverslip مع DPX القياسية لأقسام البارافين، أو DPX سميكة لأقسام راتنج غليكولميثاكريلات(الشكل 1E). تنبيه: غليكولميثاكريلات الراتنج DPX أمر خطير، لذلك تنفيذ هذه الخطوة في لغطاء محرك السيارة الدخان. ملاحظة: راتنج غليكولميثاكريلات DPX لزج للغاية. يجب الالتزام قطعة الزجاج بحزم عن طريق الضغط عليه مع ملعقة لضمان DPX هو موزعة بالتساوي ورقيقة، وليس هناك فقاعات الهواء موجودة تحت غطاء(الشكل 1F).</li>
</ol>2. تقدير Stereological لعدد بصيلات البدائية باستخدام الكسر البصري
<ol><li>قم بتشغيل الكمبيوتر ووحدة التحكم المتعدد والكاميرا ومصدر الضوء في إعداد المجسمة وحدد هدف المجهر إلى تكبير منخفض (على سبيل المثال، 10x).</li>
	<li>افتح برنامج الاستريوولوجيا.</li>
	<li>وضع الشريحة الأولى بشكل آمن على مرحلة المجهر.</li>
	<li>ضبط التعرض للضوء عن طريق التحقق من التلقائي تحت التعرض في لوحة إعدادات الكاميرا ( الشكلالتكميلي 1A). بدلا من ذلك، ضبط التعرض للضوء يدويا.</li>
	<li>استخدم عصا التحكم لتحديد موقع عينة الأنسجة الأولى ووضع العينة في بؤرة التركيز.</li>
	<li>ضبط توازن اللون الأبيض، إما عن طريق النقر على المزيد من الإعدادات (الموجود أسفل يمين لوحة إعدادات الكاميرا)، ثم انقر فوق توازن اللون الأبيض وانقر على تلقائي (الشكل التكميلي 1B). بدلا من ذلك، انقر فوق الزر توازن اللون الأبيض المجاور لزر إعدادات أكثر (أو حدد منطقة في إعدادات أكثر)،لتعيين توازن اللون الأبيض يدويا عن طريق تحديد منطقة بيضاء في القسم.</li>
	<li>انتقل إلى القائمة المنسدلة Probes وانقر على سير عمل الكسر البصري. ثم انقر فوق بدء مشروع جديد ثم انقر فوق موافق.
	<ol>
<li>إذا تم حفظ تكوين أخذ عينات موجود، ضمن معلمات أخذ العينات انقر فوق نعم | ... وحدد تكوين أخذ العينات المطلوب.</li>
		<li>إذا لم يكن كذلك، انقر فوق لا وأدخل يدويا معلومات المقطع التسلسلي(الشكل التكميلي 1C)وحدد تكوين التحقيق في الخطوة 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>انقر على التالي، تعيين المجهر إلى التكبير منخفضة واختيار التكبير 10x من القائمة المنسدلة.</li>
	<li>انقر على التالي، ثم تتبع حول قسم المبيض بأكمله - ابدأ بالنقر على اليسار حول القسم وفي النهاية ، انقر بزر الماوس الأيمن واختر إغلاق كفاف.</li>
	<li>انقر على التالي، تعيين المجهر إلى التكبير عالية واختيار 100x التكبير النفط من القائمة المنسدلة.</li>
	<li>ضع قطرة زيت على قسم الأنسجة على الشريحة وحرك هدف المجهر إلى تكبير 100x.</li>
	<li>ضبط التعرض للضوء (كما هو الحال في الخطوة 2.4) وانقر فوق التالي.</li>
	<li>إعداد معلمات أخذ العينات لتعريف تكوين المسبار. هنا، تم تعيين إطار العد إلى 47.5 ميكرومتر × 47.5 ميكرومتر (2,256.25 ميكرومتر2)وتم تعيين طول الخطوة إلى 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر (10,000 ميكرومتر2) (الشكل التكميلي 2). بمجرد إنشاء معلمات أخذ العينات، احفظ القالب ثم أعيد فتحه أثناء جلسات التحليل اللاحقة في الخطوة 2.7.</li>
	<li>انقر على بدء العد ( الشكلالتكميلي 1D). التركيز إلى أعلى العينة، انقر فوق موافق وابدأ العد.</li>
	<li>استخدام مقبض التركيز للتحرك من خلال عمق أخذ العينات 10 ميكرومتر والعد أي بصيلات البدائية التي نواة البويضات يأتي في التركيز. انقر فوق التالي للانتقال إلى المنطقة التالية.<ol>
<li>تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت تحيط البويضات من قبل الحرشفية (بالارض) الخلايا الحبيبية، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2A). ملاحظة: بصيلات البدائية متميزة عن بصيلات المتوسطة / الانتقالية، والتي تتألف من مزيج من الخلايا الجرانولوزا التكعيبية والحوازشفية (الشكل 2B)،وبصيلات الأولية، والتي تحيط بها في الغالب خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2C). وينبغي قياس هذه الفئات المسام بشكل منفصل.</li>
		<li>عد فقط بصيلات التي نواة البويضات مرئية. يجب أن تظهر نواة البويضات داخل إطار العد أو لمس خطوط التضمين الخضراء للإطار العد(الشكل التكميلي 1E، F).</li>
		<li>إذا كانت نواة البويضات تقع خارج إطار العد(الشكل التكميلي 1G)أو تلامس خطوط الاستبعاد الحمراء للإطار العد، لا تحسب هذه المسام.</li>
		<li>عند تقييم استنفاد الجريبات البدائية استجابة للمواد الكيميائية الخارجية (مثل العلاج الكيميائي) ، تأكد من أن جميع الجريبات التي تم عدها صحية وبالتالي يكون لها مورفولوجيا طبيعية(الشكل 2). عد أي بصيلات غير طبيعية أو غير طبيعية بشكل منفصل. في كثير من الأحيان ، يتم الحصول على موت الجريب عن طريق الشتائم مثل العلاج الكيميائي ، وينبغي الحصول على تحديد كمي للبصيلات اللاهوتية بشكل منفصل من أجل التمييز بين الجريبات الصحية والحرية ، حيث أن الجريبات الصحية فقط هي التي تتألف من احتياطي المبيض15.</li>
	</ol></li>
	<li>بمجرد اكتمال العد في هذا القسم، قم بأحد ما يلي:<ol>
<li>انقر فوق إضافة قسم جديد، ثم قم بالعودة إلى الخطوة 2.3 لإعداد القسم التالي للعد.</li>
		<li>انقر فوق لقد انتهيت من العد لإنهاء الجلسة. عودة الهدف إلى 10x ، والخروج من برنامج مجسمة وإيقاف مصدر الضوء ، والكاميرا ، وحدة متعددة التحكم والكمبيوتر.</li>
	</ol></li>
	<li>الحصول على مجموع عدد بصيلات الخام (س) من كل قسم الأنسجة عينات من المبيض بأكمله، ثم باستخدام جدول البيانات، واستخدام المعادلة أدناه للحصول على القيمة النهائية من كل تكرار (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">أين: N = العدد الإجمالي المقدر للبصيلات داخل المبيض. س = عدد الجريبات البدائية الخام. f1 = الفاصل الزمني لأخذ العينات. تم أخذ عينات من كل قسم3 rd وبالتالي <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> . f2 = العلاقة بين إطار الجرد (منطقة العينة) والسهوب، محسوبة على أنها <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . وبما أن منطقة العينة كانت 2256 ميكرومتر2 (47.5 ميكرومتر × 47.5 ميكرومتر) وكانت منطقة السائر 10000 ميكرومتر2 (100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر)، <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . و3 = جزء من قسم المبيض عينات. منذ 10 ميكرومتر من المقطع 20 ميكرومتر تم أخذ عينات، <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . لذلك، <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . ملاحظة: يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق مبادئ التحليلات الستيريولوجية هذه باستخدام برنامج مجسمة يستشهد به على نطاق واسع(جدول المواد)؛ ومع ذلك ، تتوفر برامج أخرى ستيريولوجية. المبادئ المطبقة خلال التحليلات التريولوجية لبصيلات المبيض هي نفسها، بغض النظر عن البرامج المستخدمة لإعداد المعلمات. علم المجسمة هو الأكثر دقة عندما يتم احتساب 100 أو أكثر من الكائنات في المبيض الماوس الكبار4، وهذا يعطي معامل الخطأ لتقدير أقل من 10 ٪16. تم تحسين معلمات أخذ العينات الموضحة هنا لضمان إمكانية حساب ما لا يقل عن 100 جسم (أي بصيلات بدائية وانتقالية وأولى) في مبايض C57BL6J البرية للبالغين. يمكن إجراء دراسة تجريبية تتضمن حجم عينة صغيرة لتحديد معلمات أخذ العينات المثلى، مثل الفاصل الزمني وعدد الأقسام التي سيتم تحليلها وعدد المشرحات البصرية داخل الأقسام التي تم أخذ عينات منها17.</li>
</ol>3. تقدير عدد الجريبات البدائية عن طريق تعداد بصيلات المبيض المباشرة
<ol><li>ضع شريحة المجهر بأمان تحت مجهر ضوء قياسي واجر عمليات عد مباشرة للحصول على عدد جريب بدائي خام.<ol>
<li>تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت البويضات واضحة للعيان وتحيط بها الحرشفية (بالارض) خلايا الجرانولوزا، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية(الشكل 2D). ملاحظة: بصيلات البدائية متميزة عن بصيلات المتوسطة / الانتقالية، والتي تتألف من مزيج من الخلايا الجرانولوزات التكعيبية والحوافر(الشكل 2E)،وبصيلات الأولية، والتي تحيط بها في الغالب خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2F). وينبغي قياس هذه الفئات المسام بشكل منفصل.</li>
		<li>تأكد من أن جميع الجريبات التي تم عدها صحية وبالتالي يكون لها مورفولوجيا طبيعية(الشكل 2). عد أي بصيلات غير طبيعية أو أحلام بشكل منفصل، كما بصيلات صحية فقط تشكل احتياطي المبيض.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بدلا من ذلك، خذ عدة، أو مخيط عالية الطاقة (على سبيل المثال، 20x) التصوير الضوئي لقسم أنسجة المبيض بأكمله لإجراء عمليات العد عن طريق فتح ملف الصورة (صور). يمكن القيام بذلك يدويا، أو باستخدام ماسح ضوئي تلقائي للشرائح.</li>
	<li>الحصول على مجموع عدد جريب الخام (س) من كل قسم الأنسجة عينات من المبيض بأكمله في الفاصل الزمني المحدد سلفا. ضرب هذا الرقم معكوس كسر أخذ العينات للحصول على القيمة النهائية لكل متماثل (N)، وذلك باستخدام المعادلة أدناه. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">أين: N = العدد الإجمالي المقدر للبصيلات داخل المبيض. س = عدد المسام الخام (من كل نوع على حدة، محسوبة بشكل منفصل). f1 = الفاصل الزمني لأخذ العينات. كل 9 تم أخذ عينات من القسمTH وبالتالي <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> . لذلك، <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

توفر هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتقنية معيار الذهب تعداد بصيلات الماوس الأولية، مجسمة، وطريقة أكثر شيوعا المستخدمة من الجريبات المباشرة العد. تم استخدام العلاج الكيميائي لمقارنة وتباين النتائج التي تم الحصول عليها من هاتين الطريقتين المختلفتين داخل المبيض الأيسر والأيمي من نفس ال...

البويضات غير الناضجة الموقوفة من الناحية العضلية المخزنة داخل بصيلات بدائية في المبيض هي وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية وتشكل احتياطي المبيض مدى الحياة للفرد. أعداد الجريبات البدائية تنخفض بشكل طبيعي مع سن1، أو بدلا من ذلك ، يمكن أن تستنفد قبل الأوان بعد التعرض للمواد الكيميائية الخارجية ، بما في ذلك بعض المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية في الهواء والغذاء والماء2. وبالنظر إلى أن عدد الجريبات البدائية محدود ، فإن كمية ونوعية الجريبات الموجودة داخل المبيض تحدد إلى حد كبير خصوبة الإناث وصحة النسل. وبالتالي، فإن التحديد الكمي الدقيق لعدد الجريبات البدائية لدى النساء أمر ضروري لتقييم الآثار غير المستهدفة للإهانات الخارجية على احتياطي المبيض.
في النساء، تحليل المبيض كله غير ممكن عموما، وبالتالي يجب استخدام التدابير البديلة غير الغازية لاحتياطي المبيض في بيئة سريرية. هرمون مكافحة Mϋllerian (AMH) هو العلامة الحيوية البديلة الأكثر استخداماسريريا 3. غالبا ما تقاس مستويات الأمصال لدى النساء في سن الأمومة المتقدمة، أو قبل وبعد علاج السرطان، مثل العلاج الكيميائي. ومع ذلك، يتم إنتاج AMH عن طريق زراعة بصيلات وليس عن طريق بصيلات بدائية، وبالتالي، مستويات المصل لا تبلغ عن عدد جريب البدائية المطلقة.
مع عدم وجود طرق لتحديد بدقة عدد الجريبات البدائية في النساء في الموقع، فإن عد بصيلات المبيض في نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل القوارض ، يبقى أداة بحثية أساسية لتقييم الدرجة التي تؤثر بها الإهانات الخارجية على الجريبات البدائية وبالتالي الخصوبة. للأسف على الرغم من, تقارير في جميع أنحاء الأدب من أعداد بصيلات البدائية في نماذج القوارض هي متغير للغاية4. ومن الأسباب الرئيسية لذلك الاختلافات التقنية المبلغ عنها على نطاق واسع في طريقة العد المستخدمة. في الغالب ، هناك تقنيتان مختلفتان موضحتان في الأدبيات لتعداد الجريبات البدائية في الفئران. وتشمل هذه المجسمة، التي تستخدم طريقة التشريح البصري الكسري، وتهم المسام المباشرة.
يعتبر علم المجسمة على نطاق واسع معيار الذهب لأنه يستخدم منهجية موحدة أخذالعينات العشوائية 5، مما يجعلها الطريقة الأكثر دقة لتحديد عدد المسام البدائية في الماوس كله ، أو المبيضين الفئران4،6،7. الستيرولوجيا غير متحيزة ، لأنها تمثل بنية ثلاثية الأبعاد للكائن المثير للاهتمام8. باستخدام طريقة تشريح بصري / كسر ، يتم تطبيق ثلاثة مستويات من أخذ العينات لتحديد الجريبات البدائية باستخدام أقسام الأنسجة السميكة (على سبيل المثال ، 20 ميكرومتر) ضمن جزء معروف من إجمالي مبيض الماوس. أولا، يتم اختيار الفاصل الزمني لأخذ العينات (على سبيل المثال، كل قسم 3rd) في بداية عشوائية (أخذ العينات كسر 1، و1)4. ثم يتم أخذ عينات من الأقسام بطريقة منهجية وموحدة من هذه النقطة من خلال المبيض بأكمله. ثم، يتم فرض إطار عد غير متحيزة على قسم المبيض وتحرك تدريجيا على طول شبكة عد محددة وعشوائية (أخذ العينات كسر 2، و2)8. وأخيرا، يتم أخذ عينات بصرية من جزء معروف من سمك القسم (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) ويتم احتساب الجريبات داخل هذه المنطقة (أخذ عينات الكسر 3، و3)4. يتم ضرب عدد الجريبات الخام في عكس هذه الكسور أخذ العينات للحصول على القيمة النهائية. تتطلب هذه الطريقة تدريب الخبراء والمعدات، بما في ذلك المجهر مع مرحلة الآلية التي يقودها البرمجيات stereological. وينبغي الحفاظ على الأنسجة في المثبتة بوين المتخصصة، وجزءا لا يتجزأ من راتنج غليكولميثاكريلات للسماح لقطع أقسام الأنسجة السميكة باستخدام ميكروتوم راتنج غليكولميتهاكريلات مع سكين زجاجية. تم تصميم هذه الطريقة لحساب انكماش الأنسجة وتشوه، للحفاظ على أفضل بنية مورفولوجية ثلاثية الأبعاد للمبيض وبصيلات9.
عد الجريبات المباشر هو الطريقة الأكثر استخداما لعد بصيلات10. يمكن استخدام مثبتات أكثر شيوعا (أي الفورماتين) ، يليها تضمين شمع البارافين والقسم التسلسلي الشامل باستخدام ميكروتوم قياسي بسماكة تتراوح بين 4-6 ميكرومتر. يتم احتساب الجريبات بشكل منهجي في قسم الأنسجة بأكمله على فاصل زمني محدد ، ثم تضرب في عكس الفاصل الزمني لأخذ العينات للحصول على تقدير الجريب الكلي. هذه الطريقة سريعة وسهلة ، ويمكن القيام بها باستخدام الأنسجة المؤرشفة ، وإعدادها باستخدام تقنيات الأنسجة القياسية. لا يتطلب سوى مجهر خفيف مع قدرات التصوير القياسية. ومع ذلك ، على الرغم من هذه المزايا ، فإن العد المباشر للجريب يفتقر إلى الدقة والمعلمات العد الصارمة للتسريو ، مما يجعله أكثر عرضة لتحيز المحقق. بالإضافة إلى ذلك ، قد تخضع الأنسجة للانكماش والتشوه أثناء المعالجة ، مما يعطل سلامة المبيض ومورفولوجياه ، وبالتالي يجعل تصنيف الجريبات وتحديد كميتها أمرا صعبا.
الهدف من هذه المقالة هو وصف طريقتين شائعتي الاستخدام لتقييم عدد الجريبات البدائية كميا في مبايض الماوس: الستيرولوجيا والعد المباشر للجريب. وسوف نقدم بروتوكولات مفصلة لهذين الأسلوبين وتسليط الضوء على بعض نقاط القوة والضعف، من أجل تعزيز الاستنساخ في مجالنا والسماح للباحثين لاتخاذ قرار مستنير من طريقة العد الأنسب لدراساتهم.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Acid alcohol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyclophosphamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td><td>Designs for Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td></tr><tr><td>Formalin fixative</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glycolmethacrylate DPX</td><td>*made in house</td><td></td><td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX50 microscope</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &amp;amp; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td></tr><tr><td>Olympus immersion oil type-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 light source</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Periodic acid</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Periodic acid 1%</td></tr><tr><td>Rotary Microtome CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Used to cut paraffin sections</td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Scott&#039;s tap water</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Stereological System</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 pcs</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 yellow</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

ولدت الثدييات الإناث استنساخ جنسيا مع كامل إمداداتها مدى الحياة من البويضات. توجد البويضات غير الناضجة والكئيبة داخل بصيلات بدائية ، وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية. وهي غير قابلة للتجديد، وبالتالي فإن عددها عند الولادة ومعدل الخسارة اللاحق يملي إلى حد كبير عمر الخصوبة للإناث. يعد التحديد الكمي الدقيق لأعداد الجريبات البدائية لدى النساء والحيوانات أمرا ضروريا لتحديد تأثير الأدوية والمواد السامة على احتياطي المبيض. كما أنه ضروري لتقييم الحاجة إلى تقنيات حفظ الخصوبة القائمة والناشئة ونجاحها. حاليا، لا توجد طرق لقياس بدقة عدد بصيلات البدائية التي تتألف من احتياطي المبيض لدى النساء. وعلاوة على ذلك، فإن الحصول على أنسجة المبيض من الحيوانات الكبيرة أو الأنواع المهددة بالانقراض للتجارب غالبا ما يكون غير ممكن. وهكذا، أصبحت الفئران نموذجا أساسيا لمثل هذه الدراسات، والقدرة على تقييم أعداد الجريبات البدائية في مبايض الفئران بأكملها هي أداة حاسمة. ومع ذلك، فإن التقارير عن الأرقام المطلقة للجريب في مبايض الفئران في الأدبيات متغيرة للغاية، مما يجعل من الصعب مقارنة و/أو تكرار البيانات. ويرجع ذلك إلى عدد من العوامل بما في ذلك الإجهاد والعمر والمجموعات العلاجية، فضلا عن الاختلافات التقنية في أساليب العد المستخدمة. في هذه المقالة، نقدم دليل تعليمي خطوة بخطوة لإعداد المقاطع النسيجية والعد بصيلات بدائية في مبايض الفئران باستخدام طريقتين مختلفتين: [1] علم التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح الجزئي/البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيمات/ التجسيم البصري؛ [1] التجسيمات الأنسجةية؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم/ التجريب البصري؛ و [2] تقنية العد المباشر. وسيتم تسليط الضوء على بعض المزايا والعيوب الرئيسية لكل طريقة بحيث يمكن تحسين القابلية للاستنساخ في هذا المجال وتمكين الباحثين من اختيار الطريقة الأنسب لدراساتهم.

واستخدم نموذج جيد الخصائص لاستنفاد الجريبات، حيث أعطيت الفئران الشابة البالغة جرعة واحدة من العلاج الكيميائي للسيكلوفوسفاميد، أو التحكم في المركبات المالحة (n=5/group) وتم حصاد المبيضين من كل بعد 48 ساعة. تم إعداد مبيض واحد لكل كما هو موضح في الخطوة 1 لكل من الطريقتين: التجسم أو العد المباشر. تم...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

هنا، ونحن نصف، مقارنة، وعلى النقيض من اثنين من تقنيات مختلفة لعد جريب دقيقة من أنسجة المبيض الماوس الثابتة.

تعداد دقيق للجريب في مبايض الفئران للبالغين

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Views.  Monash University. هنا، ونحن نصف، مقارنة، وعلى النقيض من اثنين من تقنيات مختلفة لعد جريب دقيقة من أنسجة المبيض الماوس الثابتة.

Video: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Biology

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

تطوير نموذج فأر استئصال المبيض مع مستوى FSH مرتفع

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في العلاقة بين FSH والتغيرات الفيزيولوجية المرضية لدى النساء حول فترة ما قبل الظهر - رؤى من نموذج الماوس 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.