يمكن أن يساعدنا هذا البروتوكول في توصيف الاستجابة المناعية للمضيف ضد المواد الحيوية المختلفة التي يمكن أن تساعد لاحقا في تصميم غرسات طبية مستقبلية أفضل. يعطينا قياس التدفق الخلوي معلومات حول الخلايا المناعية التي تتسلل إلى مادة حيوية تساعدنا على تحديد آليات كيفية استجابة الخلايا للإصابة وزرع المواد بالإضافة إلى أهداف لتحسين العلاجات. يمكن تعديل نفس البروتوكول لتوصيف الاستجابة المناعية في بيئات مختلفة.
تشريح العضلات الرباعية للفئران التي تلقت زرع ECM قبل أسبوع واحد وتم جمعها في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من الوسائط الخالية من المصل. أخيرا مكعبات الأنسجة باستخدام مقص. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسائط الإنزيم الهضمي إلى الأنبوب.
ضع الأنبوب الذي يحتوي على وسائط هضمية ومناديل مقطعة في حاضنة اهتزاز لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بتصفية تعليق الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة 70 ميكرون في أنبوب فردي سعة 50 ملليلتر. استخدم رأس حقنة سعة خمسة ملليلتر لهرس أي قطعة صلبة من المناديل الورقية وغسل المصفاة ببرنامج تلفزيوني بدرجة حرارة الغرفة.
تخلص من أي بقايا متبقية في المصفاة واضبط حجم الأنبوب على 50 ملليلتر مع درجة حرارة الغرفة PBS. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 10 ملليلتر من محلول EDTA البارد خمسة مليمولار في برنامج تلفزيوني. إذا كانت خلايا الدم موجودة في العينة ، فأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من محلول تحلل كرات الدم الحمراء ، واحتضانها لمدة 10 دقائق ، ثم أضف تسعة ملليلتر من EDTA.
اترك التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم اضبط مستوى الصوت على 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني بارد. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات و 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد.
نقل 10 ميكرولتر من التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة الفردية وتخلط مع 10 ميكرولتر من الرحلة والأزرق للعد. قم بتوزيع الحجم المتبقي من الخلايا في كل بئر من لوحة بئر V أسفل 96. قم بإزالة 20 ميكرولترا من الخلايا من البئر وأضفها إلى بئر جديد لاستخدامها كعنصر تحكم غير ملوث.
ثم استخدم PBS لإحضار الحجم النهائي في كل بئر إلى 200 ميكرولتر. اجمع الخلايا الموجودة في قاع آبار الألواح عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من تركيز واحد إلى 1000 صبغة صلاحية لكل بئر. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني طازج وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من واحد إلى 100 تخفيف من مانع الوحيدات. احتضان تعليق الخلية لمدة خمس دقائق على الجليد ثم أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد محمية من الضوء.
ثم اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لكل بئر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ. كرر العملية مرتين أخريين متبوعة بتعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
قبل تحليل العينة ، قم بتشغيل عينة غير ملوثة للسماح بتعديل تعداد الخلية على تشتت جانبي مقابل مخطط تشتت أمامي. بعد ذلك ، قم بتشغيل العينة الملطخة. استخراج توقيع الفلورسنت الذاتي.
ثم قم باستيراد ملفات FCS لاستخدامها كعنصر تحكم لإلغاء الخلط. انقر على أيقونة إلغاء الخلط لفتح معالج إلغاء الخلط وإجراء إلغاء الخلط باستخدام جميع عناصر التحكم في اللون الفردي عن طريق بوابة السكان الموجبة والسلبية. بعد ذلك ، انقر فوق قسم مراقبة الجودة وانظر إلى مؤشر التعقيد.
مؤشر التعقيد هو مقياس لمدى تمييز مجموعة من التوقيعات الطيفية عندما تكون التوقيعات الطيفية غير مختلطة معا. أخيرا ، قم بإلغاء خلط العينة بالنقر فوق live unmix. هنا ، يمكن ملاحظة نتائج 14 حقيقة ملونة على أنسجة الفئران المتحكمة.
في هذا التحليل ، يمكن ملاحظة العديد من مجموعات جماعات الضغط ، مثل العدلات الإيجابية ly6g و ly6c المتوسطة والعالية التي تعبر عن فئات وحيدات. CD11c عالية MHC كانت خليتان شجيريتان إيجابيتان واضحتين بسهولة عند البوابات ضد CD11b لاستبعاد البلاعم وخلايا النسب النخاعية الأخرى مثل العدلات والوحيدات. يمكن تحديد مجموعة فرعية من الخلايا المتغصنة الموجبة CD86 الموجبة CD86 من خلال التركيز على هذه المجموعة الإيجابية CD11c ، والتي تشمل كلا من CD86 عالية M1 مثل الخلايا المتغصنة و CD206 عالية M2 مثل مجموعات الخلايا المتغصنة.
أظهر F4 / 80 تدرجا في التعبير كما هو شائع في مجموعات البلاعم المختلفة. كان Siglec-F موجودا على كل من المجموعات الإيجابية والسلبية F4-80 التي تتوافق على الأرجح مع مجموعة فرعية من البلاعم والحمضات على التوالي. على الرغم من أن التلوين بعلامات سطح الخلية يسمح بعمل هذه التسميات لأنواع الخلايا ، فمن المهم ملاحظة أن الخلايا التي تعبر عن علامات مختلفة يجب أن ينظر إليها بطريقة وظيفية بدلا من التصنيف الثنائي.
عند محاولة هذا البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن فهم توقيع الفلورسنت الذاتي للعينات غير الملطخة قبل تصميم اللوحة الخاصة بك هو المفتاح لتحقيق أفضل وخلط. إلى جانب تحليل الخلايا ، يمكن تصنيف الخلايا المعزولة إلى مجموعات محددة للتقييمات النهائية باستخدام المقايسات الخلوية ، أو في المختبر ، أو التحليل النسخي ، أو للتحليل المجهري لتقييم التشكل الخلوي. يساعد التعقيد المتزايد لتحليلات قياس التدفق الخلوي للمواد الحيوية على سد الفجوة بين دراسات المناعة الأساسية وهندسة العلاجات الجديدة.
