يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتوضيح السلوك الطريولوجي وآليات ثانية ثانية الكامنة في هذا السلوك من خلال الجمع بين التحليل السلوكي الكمي مع الاحتياجات الجزيئية والكيميائية. هذه التقنية يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع مستويات المهارة لأنها لا تتطلب أدوات متقدمة أو برامج متخصصة للحصول على قراءات سلوكية كمية من اخصاريين متحركين. يمكن استخدام Scrunching لدراسة الاستثناء في الـ planarians ، ويعمل بمثابة نقطة نهاية حساسة للتشذيب ، مما يعطل وظيفة الجهاز العصبي الناجم عن Xenobiotics والمرض.
ابدأ بوضع لوحة LED قابلة للإضاءة على سطح مستوٍ، والذي سيوفر خلفية بيضاء موحدة ويمكن استخدامه كمصدر للضوء قابل للتعديل للحصول على التباين المناسب. وضع 100 ملليمتر ساحة طبق بيتري على لوحة LED. قم بتركيب كاميرا على حامل حلقة فوق الحلبة وضبط موقعها وارتفاعها وتركيزها عند الضرورة بحيث تتركز الساحة بأكملها في مجال الرؤية وهي في بؤرة التركيز.
املأ الساحة بحوالي 25 ملليلتر من وسائط التعرض المناسبة للحصول على أقصى حجم، قم بتشغيل لوحة LED وإيقاف أي مصادر ضوئية أخرى قد تؤثر سلبًا على جودة التسجيل. إسقاط بلانكاري في وسط الساحة باستخدام ماشيت نقل. عند اختبار محلول كيميائي، نقل المايناري مع أقل قدر ممكن من المياه غير المُطرية، بحيث لا يتم تغيير تركيز المادة الكيميائية بشكل كبير.
ابدأ تسجيل البيانات كتسلسلات صور بتنسيق فيجي الأصلي. بالنسبة للتجارب المزلقة ، سجل دقيقة إلى دقيقتين من سلوك الانزلاق ، لتجارب الزلق أو ال peristalsis ، سجل فترة كافية لالتقاط ما لا يقل عن ثلاثة تذبذبات متتالية تحدث في خط مستقيم. بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإنهاء التسجيل.
إذا وصل الم planarian إلى حدود الساحة دون تلبية معيار الإنهاء ، فإن الماصة تعود إلى مركز الساحة. افتح تسلسل الصورة الخام لتجربة في فيجي، وحولها إلى ثمانية بتات واستخدم أداة السهم أو شريط التمرير في الجزء السفلي من كومة الصور للتحريك عبر تسلسل الصورة. لاستخراج فترة زمنية ومنطقة ذات أهمية، رسم منطقة ذات فائدة تشمل المسار الكامل لـ planarian باستخدام أداة المستطيل.
انقر بزر الماوس الأيمن على كومة الصورة وحدد مكررة، والتحقق من مربع حيث مكدس مكررة. أدخل الإطارات الأولى والأخيرة من تسلسل الاهتمام وانقر فوق "موافق". بالنسبة لتجارب الانزلاق، استخرج فترة من الانزلاق حيث يتحرك المُنطَرِي على الأقل ضعف طول جسمه لإجراء تجارب الزمر أو الزَّق.
استخراج مثيل عندما يخضع لا يقل عن تذبذب الجسم على التوالي ثلاثة على التوالي وكاملة في خط مستقيم. تطبيق عتبة على كومة الصورة المكررة لbinarize الصورة واستخراج من الخلفية، وضبط أشرطة انزلاق بحيث يتم تمييز بلاناريان كامل باللون الأحمر. تعتمد القيم الدقيقة على جودة التصوير.
اترك المربعات لخلفية داكنة، وكومة مدرج التكراري وعدم إعادة تعيين نطاق دون رادع. قم بالتمرير عبر مكدس الصور لضمان نطاق عتبة جيد ثم انقر فوق تطبيق. في تحويل المكدس إلى إطار ثنائي، تعيين الأسلوب إلى الافتراضي والخلفية إلى الضوء.
قم بإلغاء تحديد كافة المربعات في هذه النافذة ثم انقر فوق "موافق". ستظهر صورة مُتَنَكَّلة تُظهر بلانياري أسود على خلفية بيضاء. تأكد من أن planarian كامل مرئيا في جميع إطارات تسلسل الصورة.
تعيين القياسات بالنقر فوق تحليل و تعيين القياسات. حدد المربعات لتحديد المنطقة، مركز الكتلة، وضع المكدس وتناسب القطع الناقص، ثم انقر فوق Okay. حدد كومة الصورة المفتوحة وحدد تحليل، وتحليل الجسيمات.
في إطار تحليل الجسيمات، حدد إظهار وأقنعة لفتح مكدس جديد يعرض كافة الكائنات التي تم اكتشافها باستخدام المعلمات المختارة. تعيين مرشح حجم لإزالة الضوضاء غير المرغوب فيها عن طريق إدخال المنطقة التقريبية من ا. ا. ثم حدد المربعات لعرض النتائج ومسح النتائج وانقر فوق "موافق".
حرك خلال كومة صورة القناع باستخدام شريط التمرير في الجزء السفلي من اللوحة للتأكد من عدم وجود ضوضاء أو إطارات بدون بلانكاري. في نافذة النتائج، احفظ البيانات باستخدام الملف واحفظ باسم، أضف ملحق CSV إلى اسم الملف، لحفظ البيانات كقيم مفصولة بفواصل. بمجرد حفظ البيانات الخاصة بكدسة الصور، أغلق نتائج مكدس الصور والنوافذ القناع.
للحث على scrunching عبر درجة الحرارة الضارة، والحرارة المياه البلاونية في كوب زجاجي إلى 65 درجة مئوية على لوحة ساخنة. وضع بلاناري في وسط الساحة، وانتظر حتى توجه نفسها تستقيم ويبدأ مزلق، ثم تبدأ التسجيل. استخدام P 200 ماصة إلى ببطء وباستمرار ماصة 100 ميكرولترات من المياه البلانارية المسخاة، بعد البلعوم على نهاية الذيل من البلاناري للحث على scrunching.
إيقاف التسجيل، بمجرد توقف scrunching. وضع planarian في وعاء الانتعاش وتبادل وسائل الإعلام في طبق بيتري مع المياه النقية درجة حرارة الغرفة بلاناري، إذا تشغيل المزيد من التجارب. للحث على scrunching عن طريق البتر، ونقل بلاناريان إلى وسط الساحة والانتظار حتى يوجه نفسه منتصبا ويبدأ مزلق.
ثم ابدأ التسجيل ، وبتر بلاناي بشفرة حلاقة نظيفة. التأكد من أن موقع القطع متناسق عبر التجارب. وقف التسجيل مرة واحدة في الجزء الأمامي قد توقفت scrunching.
إزالة كل قطعة، ووضعها في حاوية منفصلة والسماح لهم لتجديد لمدة سبعة أيام. يمكن إعادة دمج المبترتين في حاوية المنزل بمجرد تجديدهم. تم استخدام هذا البروتوكول لاختبار ما إذا كان بالقرب من التعرض للضوء فوق البنفسجية ، ويحفز scrunching في S.mediterranea وD.japonica planarians ، في حين D.japonica planarians scrunch ، عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة ، S.mediterranea planarians إما أن يعرض ترقق الذيل أو لا استجابة.
و quanting من المعلمات scrunching لD.japonica planarians التي عرضت ما لا يقل عن ثلاثة متتالية خط مستقيم scrunches، ويكشف عن خصائص المعلمات scrunching لهذا النوع في التعرض على النقيض من 250 cinnamaldehyde غير معروف TRPA ناهض واحد في الفئران، ويسبب scrunching وS.mediterranea. في حين أن يانيات D.japonica عرض خليط من مثل الثعابين والحركة المتذبذبة توقف من قبل مزلق أو رئيس قوي يتحول. وأسفرت عملية تحديد كمي للعينات التي لديها ثلاث ذبذبات متتالية على الأقل، عن قيم أقل بكثير بالنسبة لثلاثة من أصل أربعة بارامترات متوقعة بعد ذلك للتكشير في D.japonica، مما يشير إلى أن الحركة المتذبذبة الملاحظة ليست متأرجحة.
RNAi يؤكد خصوصية scrunching والاستجابة للتعرض cinnamaldehyde في S.mediterranea. في غضون 180 ثانية من التعرض في المياه غير المناهية، كل التحكم RNAi ابرنش. بالمقارنة مع أي من SMTRPA واحد RNAi planarians مما يدل على أن S.mediterranea scrunching في cinnamaldehyde يتطلب SMTRPA واحد.
من الضروري أن تكون متسقة وكيف يتم التلاعب الحيوانات للحد من الضوضاء وضمان إعادة إنتاج في القياسات السلوكية. ويمكن توسيع هذه المشاريع لتشمل تحليل شكل الجسم، والتي من شأنها أن تسمح لتحديد وتكميم السلوكيات الأخرى التي لا يتم التقاطها هنا.
