حتى مع انتشار تحرير الجينات لدراسة الوراثة الجزيئية للكائنات غير النموذجية ، لا يزال RNAi أداة تآزرية قوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على مراحل مختلفة من النمو. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الضربة القاضية الجزئية لدراسة هذه الجينات الكاملة.
يعتمد نجاح الإجراء على حقن DSR وجود ضرر ضئيل. هذا يأخذ الممارسة ، لذلك لا تثبط إذا كان الأمر يتطلب بضع محاولات للحصول على ذلك الحق. لإعداد الأجنة مرحلة مبكرة للحقن الجزئي، صب أولا غليان 20٪ agarose في طبق بيتري صغيرة ووضع ثلاثة واحد إلى اثنين ملليمترات أنابيب بلاستيكية واسعة على سطح agarose السائل قبل أن يتجمد.
مرة واحدة وقد عززت agarose استخدام زوج من ملقط حادة لإزالة الأنابيب وتغطية المسافات البادئة الناتجة مع 500 ميكرولترات من الماء المقطر الأوتوكلاف. عندما حاوية جمع جاهز استخدام غرامة فرشاة طلاء الشعر الطبيعي لنقل خمسة ثماني ساعات القديمة T.marmoratus الجنين من مواقع تعشيش الخنفساء في طبق تجويف زجاجي مليئة بالماء المقطر الأوتوكلاف تحت مجهر ستيريو. باستخدام المجهر وملبابات تشريح غرامة فهم chorion من كل جنين من كلا الجانبين ومزق المشيم المفتوحة مما يسمح للجنين للانزلاق بلطف من الأنسجة.
بعد إزالة كل من طبقات الترشي من جميع الأجنة التي تم جمعها استخدام فرشاة الطلاء لنقل بعناية الأجنة من طبق تجويف الزجاج في الأخادق من لوحة agarose المعدة. لحقن الأجنة المرحلة المبكرة مع جين محدد مزدوجة تقطعت بها السبل RNA أولا إعداد الإبر الحقن المجهري على إبرة puler واستخدام المجهر ستيريو والعثور على ملقط لكسر كل طرف إلى حافة حادة. بعد رمي مخزون المنقى مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA من الفائدة على الجليد، إضافة ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت حقن 10X إلى الحل الناتج واستخدام المياه المقطرة مزدوجة لتحقيق حجم الفينيل من الحل إلى 10 ميكرولتر.
استخدام ماصة P10 ل الردم واحدة من الإبر microinjection المعدة مع العمل مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA الحل وتحميل الإبرة في حامل microneedle متصلة نظام الحقن المجهري الذي يستخدم تكنولوجيا طرد الضغط. بدوره على نظام الحقن المجهري وإمدادات الهواء المضغوط واستخدام الصمام الصغير على نظام الحقن المجهري لضبط ضغط الحقن إلى 15 رطلا من الضغط لكل بوصة مربعة ثم استخدام مقبض الوقت تعديل لتعيين مدة الحقن إلى ثوان. لمعايرة حقن إبرة تقييم حجم فقاعة السوائل التي تتشكل في طرف الإبرة عند حقن في الهواء للجنين T.marmoratus استخدام حجم فقاعة الأمثل من 100 إلى 200 ميكرون.
إبرة الحقن ذات نوعية جيدة إذا كان يمكن تحقيق فقاعات الأمثل في 15 رطل من الضغط لكل بوصة مربعة مع مدة حقن حوالي ثلاث ثوان. عندما تكون الإبرة جاهزة محاذاة الإبرة على لوحة أجنة agarose بحيث تقترب الإبرة من الأجنة بزاوية 45 إلى 60 درجة. استخدم المتلاعب الصغير لتحريك الميكرون ببطء حتى تلمس التلميح سطح منتصف جنين واحد ثم قم بتحريك الإبرة بعناية إلى الأمام حتى تخترق سطح الجنين.
مرة واحدة في الإبرة داخل الجنين اضغط بعناية على زر الحقن المجهرية لتقديم واحد إلى اثنين من نانولترات من الحمض النووي الريبي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الجنين. عندما تم تسليم كل من الجيش الملكي النيبالي ببطء سحب الإبرة من الجنين دون التسبب في تمزق الجنين. يمكن تحديد الأجنة المحقونة بنجاح من خلال وجود بقعة ملونة في موقع الحقن.
عندما تم حقن جميع الأجنة بعناية وضع الطبق في غرفة الرطوبة في حاضنة 25 درجة مئوية تعيين إلى 14 ساعة ضوء دورة داكنة 10 ساعة لمدة أربعة إلى خمسة أيام. مراقبة تطور الجنين يوميا تحت المجهر ستيريو لتحديد شكليا مرئية knockdown الظاهريات. استخدام كاميرا رقمية عالية الدقة لتوثيق عملية التطوير.
إزالة أي أجنة ميتة وتجديد المياه على صفيحة أغاروز يوميا لتجنب جفاف وانتشار التلوث الميكروبي إلى الأجنة الأخرى الباقية خلال فترة الحضانة. قبل جمع اليرقة أولا إضافة 60 إلى 70 درجة مئوية 2٪ أغاروز السائل إلى طبق بيتري صغيرة. عندما عززت agarose استخدام ملقط حادة لجعل مجموعة ضحلة واحدة لكل يرقة ليتم حقنها في agarose واستنزاف المياه بلطف من أكواب ثقافة اليرقة.
بعد التخدير استخدام ملقط لينة منتهية لوضع اليرقة بعناية على لوحة شل مع الرقبة والهيئات في الأخادق ولكن الذيل الموجود فوق سطح agarose. عندما تم وضع كل من اليرقة ، وتغطي كل الحمم مع طبقة سميكة من agarose التي لا تزال سائلة ولكن ليس بشكل خطير الساخنة وخالية من أي حكايات التي تم تغطيتها بطريق الخطأ حسب الضرورة. لضعف تقطعت بهم السبل RNA microinjection تحميل microneedle مع الجين محددة مزدوجة تقطعت بهم السبل رنا حل العمل من الفائدة كما هو موضح.
Redrag المكبس من حقنة الحقن المجهرية التي تسيطر عليها يدويا وتحميل الإبرة على نظام الحقن المجهري. ضع اليرقة المُشلّة تحت المجهر الاستريو بحيث يكون موقع الحقن متوائمًا مع مسار إبرة الحقن المجهري بزاوية مسطحة نسبيًا. استخدم المتلاعب الصغير لتحريك طرف الإبرة بعناية إلى اليرقة وتطبيق الضغط ببطء وبعناية على الحقنة ، وتعديل ضغط الحقن وفقًا لحركة سائل الحقن الملون في الإبرة حسب الضرورة.
عندما تم حقن كل من الجيش الملكي النيبالي استخدام ملقط لينة لتحرير اليرقة من agarose ووضع اليرقة في حاوية جديدة من المياه درجة حرارة الغرفة في 25 إلى 28 درجة مئوية و14 ساعة ضوء دورة مظلمة 10 ساعة. في هذا التحليل التمثيلي تم إسقاط ثلاثة جينات مختلفة في مجموعة متنوعة من المراحل التنموية المختلفة لخنساء الغوص الشمسي T.marmoratus. يتم إجراء تدخل الحمض النووي الريبي كما هو موضح عن طريق حقن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في مرحلة مبكرة جدا من تكوين الجنين.
بعض الأجنة لا البقاء على قيد الحياة العملية وتحول نخرية. في هذه الصور أنها تتحكم الفردية ويمكن ملاحظة الفرد مع لون العين أخف قليلا. في هذا الفرد، ضربة قاضية أكثر شدة التي أكثر الأكاذيب البطنية من الكتلة غير مُجَدَّد تماماً ولكن الحلفاء لا تزال تظهر بعض التصبغ يمكن ملاحظتها.
هنا مثال على شخص آخر مع فقدان الصباغ كاملة أساسا في كل من العيون هو مبين. Lac2 هدمت في نتائج اليرقات في بشرة أقل مصطبغة ، تم الحصول على الأفراد البالغين أخف مع أجنحة مشوهة إلى حد ما على الأرجح بسبب ليونة غير عادية للأنسجة. تأكد من أن ننظر بدقة لمراقبة عن كثب الخاص بك حقن الحيوانات على أساس يومي وإزالة فورا أي الأفراد القتلى.
قوة هذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على جينات العديد من الكائنات الحية المختلفة. وقد تم تطبيق هذه التقنية أيضا على نطاق واسع وبنجاح على علم الأحياء التطوري.
