كانت أبحاث بيولوجيا الضامة البشرية محدودة لأنها تعتمد على جمع الخلايا من المتبرعين. يُظهر هذا البروتوكول طريقة يمكننا من خلالها إنتاج أوعية بشرية من خلايا جذعية متعددة القدرات في المختبر. هذا هو بروتوكول قوي التي يمكن توسيعها لإنتاج الضامة بكميات كبيرة لعلاجات الخلايا أو البحوث.
يمكن التلاعب بالخلايا الجذعية المتعددة القدرات وراثياً. حتى في هذا البروتوكول، يمكننا توليد الضامة مع نوع ظاهري معين، والعلامات الفلورسنت، وأيضا الضامة إلى الدول المرضية النموذجية. العرض التوضيحي المرئي لهذا البروتوكول مفيد لأن استخدام أداة المرور السهل لن يكون مألوفًا للعديد من الباحثين.
أيضا، من الصعب وضع مستوى الرعاية اللازمة عند تجديد وسائل الإعلام وخلايا الحصاد في الكلمات. عندما وصلت الخلايا المستزرعة إلى 80٪ من الالتقاء، استبدل متوسط الثقافة المستهلكة بـ 1.5 ملليلتر من الوسط الطازج. عقد وعاء الثقافة في يد واحدة، لفة أداة تمرير الخلية المتاح عبر لوحة في اتجاه واحد.
جميع الشفرات في الأسطوانة يجب أن تكون لمس لوحة. الحفاظ على ضغط موحد في حين المتداول. كرر المتداول في نفس الاتجاه حتى تم تغطية البئر كله.
تدوير وعاء الثقافة 90 درجة وتكرار المتداول. مع ماصة معقمة، واستخدام وسائل الإعلام في البئر لطرد المستعمرات قطع. استلهم CELLstart واستبدل الوسائط.
نقل الخلايا بنسبة واحد إلى أربعة إلى آبار مغلفة مسبقًا تم إعدادها كما هو موضح في المخطوطة. لبدء عملية التمايز في اليوم صفر، إضافة 2.25 ملليلتر من مرحلة واحدة وسائل الإعلام في بئرين من مرفق منخفض جدا ستة بئر لوحة. ثم لواحد 80٪ التقاء جيدا من iPSCs في لوحة ستة جيدا، استبدال وسائل الإعلام الصيانة مع 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام المرحلة الأولى.
قص المستعمرات باستخدام أداة مرور الخلايا الجديدة. باستخدام ماصة، نقل المستعمرات قطع في اثنين من الآبار من مرفق منخفضة جدا ستة بئر لوحة. في اليوم الثاني، ضبط تركيزات السيتوكين عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام SFM hESC إلى لوحة ستة جيدا تحتوي على اليوم اثنين من الهيئات الجنينية.
في اليوم الرابع، معطف أربعة آبار من لوحة ثقافة الأنسجة ستة جيدا مع 0.1٪الجيلاتين. بعد احتضان لمدة 10 دقائق على الأقل، وإزالة الجيلاتين وإضافة 2.5 ملليلتر من وسائل الإعلام المرحلة الثانية. جمع الجثث الجنينية المشكلة من بئرين من لوحة ستة آبار ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.
السماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية. ثم pirate بعناية وسائل الإعلام من الأنبوب و resuspend الهيئات الجنينية في مليلتر اثنين من وسائل الإعلام المرحلة الثانية. نقل 10 إلى 15 هيئة جنينية إلى بئر مغلفة الجيلاتين تحتوي على 2.5 ملليلتر من المرحلة الثانية من وسائل الإعلام واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، قم بتغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة إلى أربعة أيام. إن طلاء الـ EBs أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يؤدي وجود أقل من 10 أو أكثر من 15 وحدة ا ل للصرف أو توزيعها بشكل غير متساوٍ إلى انخفاض غلة الضامة.
بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، تبدأ الهيئات الجنينية في إطلاق خلايا الدم غير المُخلّقة في تعليق. باستخدام مصفاة 40 ميكرومتر، وجمع هذه الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر ومن ثم تجديد وسائل الإعلام. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلايا الدم في 200 مرة ز لمدة ثلاث دقائق.
Resuspend خلايا الدم في المرحلة الثالثة وسائل الإعلام. ثم لوحة الخلايا في كثافة 0.2 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. تغيير المرحلة ثلاثة وسائل الإعلام كل خمسة أيام.
بعد تسعة إلى 11 يوما، سيتم تمييز الضامة بشكل كامل و تعمل بكامل طاقتها. أضف ثماني مرات 10 إلى الضامة الرابعة المشتقة من iPSC إلى 200 ميكرولترات من وسائط المرحلة الثالثة إلى كل بئر من لوحة 96 بئرًا. إضافة 100 ميكرولترات من محلول حبة إلى كل بئر تحتوي على الضامة المشتقة من iPSC.
استخدم نظام تصوير عالي المحتوى لتصوير اللوحة. الحصول على ثلاثة حقول أو أكثر في كل بئر للحصول على تمثيل جيد. وكانت مستعمرات iPSC ، والهيئات الجنينية ، وخلايا التعليق الدموية ، والضامة الناضجة متميزة من الناحية الشكلية.
كانت الضامة المشتقة من iPSC كبيرة ، وكان لها نواة بيضاوية صغيرة واحدة وكان لها سيتوبلازم وفيرة تحتوي على العديد من الحويصلات. تم تقييم النمط الظاهري الضامة بواسطة قياس التدفق. عبّر الضامة المشتقة من iPSC الناضجة عن علامة النسب CD45 وعلامة نضوج الضامة 25F9 وكانت سلبية بالنسبة لعلامة الضامة غير الناضجة أحادية البديهة CD93.
عبّر عن الضامة المشتقة من iPSC عدة علامات النخاع النسب وكانت إيجابية لعلامة التشكيل المناعي CD86. وأعرب نسبة صغيرة من الضامة مستقبلات chemokine CX3CR1، CCR2، CCR5، وCCR8. تم تقييم قدرة البلعة iPSC-DM باستخدام الجسيمات الحيوية ونظام التصوير عالي المحتوى.
كانت الجسيمات الحيوية غير فلورية عندما تضاف إلى الثقافات الضامة، ولكن بعد البلعوم الفلوري مشرق الأخضر في الأس الهيدروجيني الحمضية داخل الخلايا. يمثل الجزء البلعائي نسبة الضامة التي يتم تناولها بالجسيمات الحيوية باللاتفات والمؤشر البلعوسي هو مقياس عدد الجسيمات الحيوية التي يتناولها كل كبري. يمكن أن تغير الضامة النمط الظاهري استجابة للإشارات البيئية.
تم استخدام RT-PCR لتحديد كمي التعبير الرنا أعلى من الجينات. أظهر الضامة المعالجة بـ LPS و INTERFERon gamma أو IL4 نسبة أقل بكثير من الخلايا البلعوية بالمقارنة مع الضامة الساذجة. أظهر الضامة المعالجة بـ IL10 زيادة في نسبة الخلايا البلعوية ومؤشرًا بالبلعية المتزايد.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتوفير مصدر جاهز للخلايا لعلاج أمراض مثل أمراض الكبد المزمنة حيث ثبت أن الضامة علاجية في النماذج الحيوانية. يمكن استخدام الضامة المشتقة من iPSC لدراسة الضامة المرتبطة بحالات المرض المتعددة. على سبيل المثال، نستخدم هذه الخلايا لدراسة الضامة المرتبطة بالأورام في سرطان الثدي.
لقد قمنا بتعديل النمط الظاهري لل الضامة المشتقة من iPSC بواسطة البرمجة الجينية باستخدام عامل نسخ واحد يسمى KLF1. مع هذا، أنتجنا الضامة التي تبدو وكأنها الضامة جزيرة erythroid وأنها قدمت رؤى في إنتاج ونضج خلايا الدم الحمراء.
