تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق

يسمح هذا البروتوكول بالتوليد البسيط لشبكات الأنابيب النانوية الدهنية واسعة النطاق التي تعرض فيها الأنابيب النانوية الفردية سلوك فصل الطور المشابه لسلوك الحويصلة الأم. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أننا نستوعب العمل الذي تقوم به المحركات الجزيئية لتجميع الأنابيب النانوية الدهنية ذاتيا بطريقة متوازية للغاية ودون تدخل بشري. لإعداد فحص حركية الانزلاق ، أولا ، قم بلصق ثلاث مجموعات من شرائط الشريط على الوجهين على شريحة زجاجية تفصل بينها خمسة ملليمترات.

اضغط برفق على غطاء ينزلق على الشريط وأضف 30 ميكرولتر من محلول كينيسين ميكرومولار واحد إلى خلية التدفق المحضرة. بعد خمس دقائق ، أضف 30 ميكرولتر من محلول microtubule 10 ميكروغرام / ملليلتر إلى الخلية ، مع الضغط على مسح المختبر برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. بعد خمس دقائق أخرى من الحضانة ، اغسل الخلية مرة إلى ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من محلول حركية درجة حرارة الغرفة لكل غسل قبل إضافة 30 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام / ملليلتر إلى خلية التدفق.

بعد 10 دقائق ، أضف 30 ميكرولتر من محلول GUV 10X لحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ميكرولترين من محلول AMP-PNP 100 ملليمول وأغلق الغرفة بمادة مانعة للتسرب. انقل غرفة التدفق إلى مجهر مقلوب للتصوير وحدد مجموعة المرشحات المناسبة.

استخدم هدف الزيت 100X للتركيز أولا على سطح الغطاء قبل الحصول على صورة لشبكة ذات أهمية. ثم افتح الصورة في ImageJ وانقر فوق الصورة واللون والمركب لتراكب القنوات الحمراء والخضراء لإنشاء صورة مركبة. بعد التصوير ، افتح الصورة ذات الاهتمام وانقر فوق تحليل وتعيين مقياس لمعايرة مقياس المجهر.

املأ وحدات البكسل بعامل تحويل الميكرومتر وانقر فوق موافق. استخدم أداة الخط متعدد النقاط لتتبع الأنابيب النانوية بدءا من GUV الأصلي واضغط مع الاستمرار على Control و M لقياس الطول. ستقوم أداة معالجة الصور بحفظ كل قياس جديد في نافذة النتائج. عند قياس جميع الأنابيب، حدد صورة وضبط وعتبة وانقر فوق تطبيق لتطبيق العتبة.

ثم ارسم مستطيلا بطول معروف فوق الأنبوب المطلوب. لقياس الكثافة المتكاملة للمنطقة، انقر فوق تحليل وقياس لتحديد تقسيم الدهون في عقد الأنابيب النانوية السائلة، استخدم أداة الخط لرسم خط فوق العقدة محل الاهتمام وقياس شدة العقدة في كل من القناتين الخضراء والحمراء. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تصنيع شبكات الأنابيب النانوية السائلة كما ثبت لتوليد مراحل مضطربة ومرتبة بالسائل ، بالإضافة إلى حويصلات مفصولة عن الطور.

على سبيل المثال ، الحويصلات التي يتم تصنيعها مع 45٪ من الدهون المشبعة و 55٪ من الدهون غير المشبعة تؤدي إلى حويصلات تنفصل إلى مراحل سائلة مضطربة وصلبة متعايشة. ومع ذلك ، إذا تم تضمين الكوليسترول ، فيمكن ملاحظة التعايش بين السائل والسائل ، مما يخلق GUVs تنفصل إلى مراحل مختلطة من السائل ومضطربة السائل. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة العقد داخل المخاليط المنفصلة عن الطور.

أهم شيء يجب تذكره هو اختيار وقت التعرض المناسب ومرشح ND المحدد ليكون قادرا على تصور الأنابيب النانوية الدهنية دون تبييض الفلوروفورات ضوئيا. يسمح لنا تصميم تكوين سلوك الطور للأنابيب النانوية الدهنية باستخدام نظام نموذج أضيق الحدود لبدء دراسة الفيزياء الحيوية للأنابيب النانوية النفقية التي تربط الخلايا.